（1）Jackson等學者的研究指出siRNA 5′端在1～6和3～8位置高度富集六聚體引物；Lin等在實驗中也發現了一些假陽性的靶點，且siRNA文庫顯示了與siRNAs引導鏈的5′端互補的序列。這些均提示由於引導鏈的這個位置與miRNA 5′端的中心區域類似，這些序列與轉錄的siRNA的一部分尤其是在siRNA引導鏈的5′端互補，使得在基因調節中出現非目的的翻譯抑製和（或）mRNA降解。可以看出，這種與siRNA 5′端最初的8個核苷酸互補的方法對脫靶效應的產生非常重要。
（2）許多的研究都通過基因芯片來監測脫靶效應。根據芯片實驗，siRNA可引起高比率的非目的轉錄產物的沉默，同時顯示下調的非目的基因有與siRNA轉錄產物3′UTR互補的序列，而且最富及六聚體引物的3′UTR與2～7核苷酸互補，說明中心區域對小分子RNA靶基因的重要性。siRNA中心區域的堿基錯配降低該係列原始的非靶標轉錄產物，但產生了一係列與錯配中心區域序列互補的新的沉默轉錄產物。
（3）可誘導的shRNA沉默轉錄產物的子集能被一個同樣序列的siRNA沉默，證明這種非目的沉默是序列調節的，而且不依賴於導入的途徑。在許多的例子中，非目標轉錄產物伴隨相應蛋白的丟失，同時依賴於siRNA的濃度，與沉默靶標轉錄產物的濃度相似。所以，與siRNA短長度的序列互補或shRNA中心區域對非目的轉錄產物沉默很重要。
14.1.1.2脫靶效應的調節
siRNA調節大量轉錄產物的能力與miRNA調節大量轉錄產物的能力相似。脫靶效應轉錄物表達模式有序列特異性和靶特異性兩種。目標轉錄產物與非目標轉錄產物的沉默並不能通過降低siRNA的濃度或縮短轉錄的時間而加以區別。也就是說，不僅僅是高濃度能產生脫靶效應的假象，低濃度也可能產生脫靶效應。同樣，在表型文庫中的靶點和非靶點也不能通過降低siRNA的濃度來加以區別。在蛋白和mRNA水平對脫靶效應同時進行考慮分析時，要縝密分析和確定時間點。特別是要確定脫靶效應是否是蛋白被敲低的次級效應，因此要分時序性進行分析。對靶蛋白和目的轉錄本進行半衰期分析或者獲取相關的資料。在蛋白效應以前通過表達圖譜分析確認非次級效應影響。通過觀察降解靶轉錄本和靶蛋白效應時間分水嶺可以判定是否為次級基因表達改變所影響的。
14.1.1.3脫靶效應產生的後果
14.1.1.3.1siRNA的脫靶效應能誘導毒性表型
基因芯片的研究提供了RNAi的脫靶基因調製，但是否這些變化會產生可觀察到的表型？已有研究證明脫靶效應存在產生非常廣泛表型的現象，文庫中將近30％的可確認的陽性表型是由脫靶效應產生。研究顯示細胞發育的表型可由RNAi決定，即隨機的選擇性的siRNAs片段能以靶標依賴的形勢誘導細胞發育能力的變化。首先，當RNAi機製中的一個重要成分EIF2C2（hAgo2）被阻斷，能明顯緩和毒性siRNAs誘導的細胞死亡，而EIF2C2-的細胞轉染毒性siRNA，細胞的發育並沒有降低。其次，進一步的研究證明當雙鏈的長度減少至17個堿基以下，毒性siRNA的毒性水平將大大降低，這說明對毒性的誘導需要RISC的加工或進入。對毒性和非毒性雙鏈進行進一步分析發現，毒性與毒性siRNA RISCentering鏈中4-堿基對基序（UGGC）之間存在很強的聯係。因此，siRNA誘導的脫靶效應能產生可測量的表型，觀察到的毒性需要一個完整的RNAi途徑，但是該毒性能被附加的化學修飾如siRNA seed區域的2′-O-甲基修飾所消除，這樣就能限製脫靶基因的數量，改變靶標特異性的敲低效應。
14.1.1.3.2siRNA與脫靶效應能激活先天免疫反應
作為抵抗外侵病原體的先天防禦機製的一部分，哺乳動物的免疫係統會被許多外源性的RNA和NDA激活，引起炎性細胞因子和幹擾素如IFNα的釋放。未經過修飾的siRNAs能誘導細胞因子，產生毒性以及脫靶效應。當與促進細胞內攝取的導入顆粒聯係時，未經過修飾的siRNAs能潛在地激發先天免疫反應。對於siRNA脫靶效應的最初的研究主要集中在從細胞株中誘導幹擾素樣反應，主要是通過dsRNA依賴的蛋白激酶（PKR）的激活。Ian MacLachlan和其他的研究報道合成的siRNA是鼠和人先天免疫係統的潛在催化劑，尤其當與脂質或聚陽離子載體結合，通過內涵體更易導入細胞內。這種與炎性反應有關的毒性和脫靶效應成為siRNA治療性發展的障礙。
選擇性的將2′-O-甲基尿嘧啶或鳥嘌呤核苷整合到siRNA雙鏈的一條鏈中，能減少脫靶效應，完全消除合成的siRNA引起的免疫刺激。這些非炎性的siRNA，包括少於20%的改良的核苷酸，能被迅速地產生，而不影響它們的基因沉默效應。又如靶向載脂蛋白B（ApoB）的2′-O-甲基修飾的siRNA能調節它所靶向的mRNA的潛在的沉默效應，引起血ApoB和膽固醇的明顯降低。在Rapeutically viable siRNA劑量時就能達到該效應，而沒有產生與應用未修飾的siRNA有關的細胞因子誘導、毒性或脫靶效應，證明這種siRNA的設計和導入的方法具有廣泛應用性，代表了推動合成的siRNA進入廣泛的治療領域中時重要的一步。
siRNA的免疫識別是序列特異性的，而且很可能通過內涵體的Toll樣受體7（TLR7）途徑參與信號傳導。由於低劑量的TLR配基能觸發局部或全身的炎性反應，這種先天免疫反應的激活後果是嚴重的，尤其在包括人類在內的敏感種類中。毒性與siRNA體內劑量有關。如何克服這種免疫反應，有以下幾個措施：①在ssRNA（單鏈RNA寡核苷酸）中2′-O-甲基修飾物消除免疫刺激。為了測試化學修飾的程度和類型，需要通過RNA抑製免疫細胞活性，有選擇地將2′-O-甲基核苷酸整合到來源於h-半乳糖苷酶siRNA的ssRNA的富集GU的免疫刺激的基序。證實ssRNA中選擇性地整合2′-O-甲基修飾的核苷酸能充分地阻止來源於先天免疫細胞的幹擾素樣反應的刺激。②siRNA中選擇性的核苷酸修飾能消除免疫刺激。在鼠和人類中似乎大部分短RNA雙鏈的免疫識別的潛在機製都保留了下來。在以上兩個中的任何一個物種，通過RNA雙鏈的任何一個單鏈中整合盡可能少的2′-O-甲基修飾的核苷酸都能深刻打斷這種機製。③對RNA正義鏈的嚴格修飾能幫助保持RNAi的活性。對RNA正義鏈的選擇性修飾提供了通過RNA的強有力的方法來克服免疫激活的問題，從而降低RNAi負性影響的幾率。由於siRNA序列具有刺激先天免疫反應的內在能力，所以這種方法能應用到一些方麵。④體內沒有免疫刺激的潛在的RNAi活性。脂質包裹的siRNA為全身應用提供充分的血清穩定性，否定了對RNA廣泛化學修飾的需要。在肝髒疾病中，伴隨著siRNA的高效導入，有效負荷至靶器官，有助於內源性基因的沉默。