正文 第一節分子標記的種類與基本技術2(2 / 3)

AP-PCR標記原理上與RAPD極為相似,所用擴增引物的核苷酸序列是隨機的,但所使用的引物較長,通常為18~24個堿基(最長可達50個堿基)。AP-PCR所擴增的DNA區段是事先未知的,應用這種標記技術可以基因組中尋找未知的多態性位點作為DNA標記。因此,AP-PCR與常規PCR反應條件一樣,穩定性要比RAPD好,但揭示多態性的能力要比RAPD低。隨機引物PCR擴增的DNA區段產生多態性的分子基礎是模板DNA擴增區段上引物結合位點的堿基序列發生了突變。因此,不同來源的基因在該區段(位點)上將表現為擴增產物有/無的差異或擴增片段大小的差異。其中第1種情況較為常見,因此隨機引物PCR標記通常是顯性的,但有時也會表現為共顯性,即擴增片段大小的差異。

DAF標記原理上與RAPD標記相似,但它所使用的引物比RAPD標記的更短,一般為5~8個核苷酸,因而與模板DNA隨機結合的位點更多,擴增得到的DNA條帶也更多,檢測多態性的能力更強。在多態性程度比較低的作物如小麥、棉花、油菜等作物上,DAF技術是一種十分有用的尋找分子標記的手段。但由於DAF使用了更短的引物,因而其PCR穩定性比RAPD更低。

特異引物PCR標記所用的引物是針對已知序列的DNA區段而設計的,具有特定核苷酸序列,引物長度通常為18~24核苷酸,故可在常規PCR的複性溫度下進行擴增,在分子標記輔助育種方麵發揮巨大作用。

以上3種不同類型的PCR標記的差異主要在於它們所使用的引物不同:AP-PCR使用的引物較長(10~50個堿基),但PCR反應前2個循環的嚴謹條件較低,最終的反應結果與RAPD類似;DAF所使用的引物K度比RAPD短,甚至可短至5個堿基,因此提供的譜帶信息比RAPDs多得多。這3種類似PCR分子標記中,RAPD使用更為廣泛。

(六)SCAR標記和STS標記

1.SCAR標記

序列特征性擴增區域(sequencecharacterizedamplifedregion,SCAR)。SCAR標記是在RAPD標記等技術基礎上發展而來的。RAPD標記所使用的引物通常比較短,因此,RAPD標記的穩定性與RFLP標記相比要差。然而在實際的研究分析過程中(例如基因定位、分子標記輔助選擇),通常要求所使用的標記具有很高的穩定性。因此,為了提高RAPD標記的穩定性在經過第l輪的篩選以後通常將該RAPD標記片段從瓊脂糖凝膠上回收並進行克隆和測序。根據測序以後片段的堿基序列設計一對特異引物(18~24個堿基左右)能夠穩定地對該片段進行特異擴增。

如果回收克隆以後的片段比較長(>2kb),也可以隻對該RAPD標記片段的末端進行測序。根據片段的末端序列,在原來RAPD所用的10堿基引物的基礎上增加一個引物用於PCR反應。增加堿基(14個左右)的引物是與原RAPD片段末端互補的特異引物。以基因組DNA為模板,以這個特異引物和隨機引物進行配對再次進行PCR擴增,便可以擴增出與所克隆片段同樣大小的特異帶型。這種由RAPD分析片段經過轉化以後的特異DNA分子標記被稱之為SCAR標記。

SCAR分子標記一般表現為擴增片段的有/無,是一種顯性標記;但有時也表現為擴增片段長度的多態性,屬於共顯性的標記。SCAR標記的分析與RAPD標記的分析過程上沒有顯著變化。SCAR標記的分析過程通常是:①通過RAPD分析獲得差異片段;②克隆差異片段並進行測序;③根據片段序列設計一對引物對新的樣品進行PCR擴增;④對擴增片段進行分析。如果待檢測的DNA樣品之間的差異表現為擴增片段的有/無,可以直接在PCR反應物中加入溴化乙錠,經過電泳以後在紫外燈下觀察有/無擴增產物,從而檢測DNA樣品之間的差異。SCAR標記由於穩定性強,使得分析檢測變得更為方便、快捷、可靠,因而可以快速檢測大量個體。

2.STS標記

序列標簽位點(sequencetaggedsite,STS)。STS標記是根據單拷貝的DNA片段兩端的序列,設計一對特異引物,擴增基因組DNA而產生的一段長度為幾百堿基的特異序列。STS標記采用常規PCR所用的引物長度,因此PCR分析結果十分穩定可靠。RFLP標記經過兩端測序,亦可轉化為STS標記。STS位點在基因組中往往隻出現一次,從而能夠界定基因組的特異位點。利用STS進行物理作圖,可通過PCR或雜交途徑來完成。STS標記可作為比較遺傳圖譜和物理圖譜的共同位置標簽,因而在基因組作圖上具有非常重要的作用。

(七)AFLP標記技術

擴增片段長度多態性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP)。AFLP分子標記技術是1993年由荷蘭科學家Zabeau和Vos等人創建的。該技術是利用PCR技術檢測DNA多態性的一種方法,1993年獲得歐洲專利局專利。隨後,荷蘭Keygene公司買下該技術專利後將其商品化,1994年推出AFLP分析係統的試劑盒。AFLP技術在試劑盒公開銷售以後很快就被人們熟悉並廣泛傳播,因此Zabeau等人不得不在1995年以論文的形式將該技術公開發表。

1.AFLP標記的基本原理及操作

(1)AFLP的基本原理AFLP的基本原理是選擇性擴增基因組DNA的基本原理,也就是選擇性擴增基因組DNA的酶切片段來獲得不同DNA樣品之間的遺傳差異。利用限製性內切酶對基因組DNA進行酶切,產生黏性末端。酶切片段首先與具有共同黏性末端的人工接頭連接,連接後的黏性末端序列再與接頭序列相互連接產生可用於擴增的PCR反應的底物片段。利用不同的DNA樣品作為PCR反應的模板,以接頭序列作為PCR反應的引物結合位點進行PCR擴增獲得不同樣品之間的遺傳差異。

AFLP接頭是一種人工合成的DNA雙鏈分子,長度一般為14~18個核苷酸,由核心序列(coresequence,CORE)和內切酶特異序列(enzymespecificsequence,ENZ)所組成。AFLP標記的PCR擴增引物分為3部分:核心序列、限製性內切酶識別位點序列和選擇性核苷酸序列(selectiveextension,ENT)。核心序列要求與人工合成的接頭序列互補。選擇序列具有可變性,在實際工作中,根據具體工作需要人為設立選擇性核苷酸序列,其序列可由1~3個選擇性核苷酸組成,以達到選擇性擴增的目的。對於同一基因組DNA而言,選擇性核苷酸的數目越多,選擇性越強,擴增出來的產物就越少;相反,它的數目越少,選擇性就差,擴增出來的產物就多。

(2)操作根據以上的分析可以知道,AFLP分子標記的操作過程可以分為3個基本的步驟,包括模板DNA製備、酶切片段的選擇性擴增及凝膠電泳分析。

①模板DNA的製備在進行AFLP分析時,首先要製備高相對分子質量基因組DNA。在製備DNA的過程中要特別避免核酸酶及各種使DNA失活物質的汙染。

②限製性內切酶對DNA進行酶切利用限製性內切酶對DNA進行酶切要充分,這是AFLP技術成功的關鍵。通常利用兩種限製性內切酶酶切,一種酶的識別位點是6個堿基,而另一種限製性內切酶的識別位點是4個堿基,如EcoRI和MseI,選擇這樣兩種酶共同酶切可以產生比較小的酶切片段。以這種長度的酶切以後的片段作為PCR反應模板擴增出的產物主要在lkb左右,長度範圍可能在100~1500bp之間。

③酶切片段與引物的連接和選擇性擴增一般是生物基因組DNA經限製性內切酶雙酶切後,形成分子量大小不等的隨機限製性片段,將特定雙鏈接頭(adapter)連接在試些DNA片段的兩端,形成一個帶有特定接頭的DNA分子就可以作為DNA擴增的模板。接頭序列以及與其相連的限製位點作為隨後進行的限製片段擴增的引物結合位點。PCR引物3′末端含有選擇核苷酸,選擇核苷酸可以延伸到片段的酶切位點,這樣就隻有那些兩端序列能與選擇核苷酸配對的限製性酶切片段才能夠被識別和擴增。酶切片段要經過連續2次PCB擴增,通過這樣兩步擴增反應使產生的擴增結果更清楚、重複性更好。利用酶切後連接產物作為模板,用人工合成的選擇性單鏈寡核苷酸作為引物進行預擴增。然後將預擴增產物稀釋若幹倍數以後再進行選擇性擴增反應。選擇性擴增反應所用的引物中選擇性核苷酸數目的多少是決定擴增產物多少的主要因子。