④擴增產物的凝膠電泳分析選擇性擴增產物一般在5～6％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然後根據引物的標記性質對產物采用相應的檢測方法。檢驗的方法一般包括放射性自顯影檢測、熒光標記方法進行檢驗、銀染檢測和EB染色檢測。
2.AFLP標記的分析基本流程和操作
AFLP分析包括以下5個基本步驟。①基因組DNA提取。②限製性酶切分析。③接頭的連接。④預擴增和擴增。⑤產物的分離與檢測。
(1)基因組DNA提取植物基因組的方法已經非常成熟，在很多的參考文獻中都有報道。在前文有關RFLP、RAPD標記中也已經介紹了多種方法。這些DNA的抽提方法隻需要根據具體的材料稍微修改就可以獲得很好的抽提效果。用於AFLP標記分析的DNA要求質量比較高，但是總量上與RFLP分析的方法相比要小很多。一般在幾個微克的DNA就可以。根據這個原則，我們介紹一種在我們實驗室采用的一種快速提取DNA的一種方法。
選取0.5g植物嫩葉於預冷的研缽中，加1.0ml提取液（0.1mol/LTris-HCl，pH8.0；50mmol/LNa2-EDTA，0.5mol/LNaCl；10mmol/Lβ-ME）將其研磨為勻漿，轉入1.5ml的離心管中。然後在65℃的水浴中溫育30min。水浴結束以後接著在13000r/min離心5min，離心結束以後收集上清液（大約0.7m1）。在上清液中加入2/3體積預冷的異丙醇，冰上放置30min後13000r/min離心8min收集DNA。DNA沉澱物用400μl的TE溶液溶解，加入4μl的RNaseA（10mg/m1）溶液以後在37℃保溫1h除去溶液中的RNA。DNA溶液然後分別用等體積的苯酚︰氯仿︰異戊醇混合物（25︰24︰1）以及氯仿：異戊醇混合物（24︰1）各純化1次。取出上清液最後加入2倍體積的無水乙醇，13000r/min離心10min收集DNA。吹幹DNA後用100μ1的ddH2O溶解，﹣20℃保存備用。有時候為了獲得質量更高的DNA，在利用苯酚︰氯仿︰異戊醇進行純化以前，加入蛋白酶K進行消化緩衝液中的蛋白質有利於提高DNA的抽提質量。
(2)限製性酶切分析用於限製性酶切分析的酶類組合中通常有2種限製性內切酶，一種是EcoRI，另外一種是MseI。但不管是哪一種的限製性內切酶組合，限製性內切酶MseI是共同需要的，其他的限製性內切酶可以是EcoRI、BamHI、HindⅢ等不同的酶類。取200～500mg的基因組DNA，加入2單位的EcoRI和2單位的MseI，在25μl酶切反應總反應體係中加入一定體積的緩衝液使其終濃度為1×酶切緩衝液，將酶切反應的緩衝液放人水浴中進行酶切，酶切4h以後檢測酶切片段的長度。如果片段的長度在50～800bp之間，說明酶切完全。
(3)接頭的連接接頭的連接可以與限製性酶切分析步驟結合在一起，也可以單獨進行連接反應。有關連接反應的反應體係根據不同公司的連接酶反應體係有所變化。但是總的要求是，用於連接反應的DNA的量一般在200～500ng，反應的體係控製在20μl左右。將酶切結束以後的酶切混合液置於22℃連接4h或過夜連接，然後稀釋10倍作為預擴增的模板。
(4)預擴增和擴增
①連接產物的預擴增在25μl的PCR反應體係中，加入各種所需的反應物使其含有50ng的EcoRI引物（5′-GTAGACTGCGTACCAATTCA-3′），50ng的MseI引物（5′-GACGATGAGTCCTGAGTAAC-3′），5μl連接產物，0.2mmol/LdNTPs，1UTaq酶，1×PCR緩衝液（10mmol/LTris?HCl，pH8.3；50mmol/LKCl，2.0mmol/LMgCl2）。PCR反應體係循環參數：94℃（30s）、56℃（30s）、72℃（1min）；25個循環。取5μl預擴增產物於1.5％瓊脂糖凝膠檢測，相對分子質量應在50～800bp之間，無拖尾現象。反應剩餘產物稀釋10倍以後作為選擇性擴增的模板。
②選擇性擴增在20μlPCR反應體係中含有3～5μl預擴增產物，50ngEcoRI+3個堿基的引物（5′-GTAGACTGCGTACCAATTCAACC-3′），50ngMseI+3個堿基的引物（5′-GACGATGAGTCCTGAGTAACCAT-3′），0.2mmol/LdNTPs，1UTaq酶，1×PCR緩衝液（含2.0mmol/LMgCl2）。第1個循環參數為94℃（30s）、65℃（30s）、72℃（1min），此後每個循環的複性溫度下降1℃，共計10個循環，然後在94℃（30s）、56℃（30s）、72℃（1min）的條件下運行25個循環。
(5)產物的分離與檢測
①PAGE膠製備用洗滌劑將電泳玻璃徹底洗淨，首先以去離子水淋洗，然後用無水乙醇淋洗並晾幹。在長膠板上均勻塗抹1ml矽化液。在短膠板上均勻塗上lml反矽化液（95％乙醇，0.5％冰乙酸2μl反矽化劑），放置5min後用95％乙醇輕輕擦洗以除去多餘的矽化液和反矽化液。將玻璃裝配好並以邊條（0.4mm）隔開，小心套入製膠夾中。準備就緒後用注射器將50ml變性凝膠混合液（6％丙烯酰胺，7mol/L尿素，0.5×TBE緩衝液，灌膠前加入300μ110％過硫酸銨和30μ1TEMED並迅速混勻）從製膠夾底部小孔緩緩注入，最後插入梳子並加夾子保護，凝聚2h後即可電泳。
②預電泳和電泳將玻璃外側固定於電泳槽上，分別在電泳槽的上下槽各加入500m1的0.5×TBE緩衝液，將梳子拔出後立即用電泳緩衝液清洗點樣孔，接通電源後在60V的電壓下預電泳30min。在選擇性擴增產物中加入等體積的上樣緩衝液（98％去離子甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.005％二甲苯青FF，0.005％溴酚藍），然後在95℃條件下變性3min後立即進行冰浴冷卻。取出變性後的上樣緩衝液5μ1點入電泳的點樣孔中，在60V的電壓下電泳90min左右，當二甲苯青FF跑過2/3膠板時終止電泳。
③染色電泳結束後取下膠板，用蒸餾水洗淨玻璃外側並小心將其分開，把黏附有凝膠的短膠板浸入1.5L固定液中（10％冰乙酸），輕輕搖動20min或至指示劑消失為止，然後用去離子水漂洗短膠板2次，每次3min。洗畢，轉至1.5L染色液中（0.1％AgNO3，0.056％HCHO）中輕輕搖動染色30min。取出短膠板，在雙蒸水中迅速漂洗20s，馬上轉入到1.5L預冷（10℃）的顯影液（3％Na2CO3，0.056％HCHO，2mg/LNa2S2O3?5H2O）中，輕輕搖動至條帶清晰可見後倒入終止液（10％冰乙酸）停止顯影，然後用蒸餾水漂洗3min，室溫下自然晾幹，拍照保存。
AFLP結合了RFLP和RAPD各自的優點。AFLP技術方便快速，隻需要極少量DNA材料，不需要Southern雜交，不需要預先知道DNA的順序，條帶呈共顯性，檢測信息量大，處理樣品數量多，靈敏度高，易於操作，而且可產生豐富而穩定的遺傳標記。由於AFLP標記具有以上諸多的優點可以用於遺傳分析的各個方麵，如遺傳多樣性和種質鑒定、分類、係統發育、基因定位、遺傳圖譜構建及目的基因定位等各項研究。
以上幾大類DNA標記，都是基於基因組DNA水平上的多態性和相應的檢測技術發展而來的，這些標記技術都各有特點。任何DNA變異能否成為遺傳標記都有賴於DNA多態性檢測技術的發展，DNA的變異是客觀的，而技術的進步則是人為的。隨著現代分子生物學技術的迅速發展，隨時可能誕生新的標記技術。DNA標記的拓展和廣泛應用，最終必然會促進植物遺傳與育種研究的深入發展。