(五)RAPD標記及其衍生的分子標記
PCR技術是1985年Mullis等發明的一種核酸分子體外擴增的技術。該技術利用DNA聚合酶酶促反應對特定DNA片段進行擴增，該技術隻需非常少量（通常在ng級範圍內）的DNA樣品，在短時間內以樣品DNA為模板合成上億個拷貝。擴增產物經過電泳分離、染色或放射自顯影，即可顯示所擴增的特定DNA區段。在聚合酶鏈式反應（PCR）技術的基礎上，Williams等采用隨機核苷酸序列（10個堿基）擴增基因組DNA的隨機片段，獲得了一種新的分子標記，即隨機擴增多態性DNA（randomamplifiedpolymorphismDNA，RAPD）。
1.RAPD標記的基本原理
RAPD技術是PCR技術的延伸。RAPD標記的原理是利用一係列（通常是數百個，例如Operon公司的隨機引物）不同的堿基隨機排列的寡聚核苷酸（通常為9～10個堿基）單鏈作為引物對所研究的基因組DNA進行PCR擴增。擴增產物通過聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離、EB顯色或放射性自顯影來檢測擴增DNA片段的多態性，這些擴增的DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性。
RAPD標記所用的一係列引物的DNA序列雖然各不相同，但對於任何一個特定的引物而言，它同基因組DNA序列有其特定的互補結合位置。這些特定的結合位置在基因組中某些區域內的分布如符合PCR擴增反應條件，即引物在模板上的兩條鏈上如有互補位置，並且引物3′端相距在一定的長度範圍內，就可以擴增出該區段的DNA片段。因此，如果基因組在這些區域內發生DNA片段插入、缺失或堿基替換，就可能導致這些特定的結合位置分布會發生相應的變化而使PCR產物增加、缺少或發生相對分子質量改變。通過對PCR產物的檢測，就可以檢測出基因組DNA在這些區域內的多態性。
RAPD標記所采用的引物長度通常為9～10個堿基，大約隻有常規PCR引物（20～30個堿基）長度的一半。使用較短PCR引物是為了提高引物揭示DNA多態性的能力。由於引物長度比較短，所以在PCR中必須使用較低的退火（DNA複性）溫度，以保證引物能夠與模板DNA結合。由於進行RAPD分析時所采用引物數量很多而且引物序列的堿基組成呈隨機排列，因此，理論上RAPD標記所檢測的區域可以覆蓋整個基因組。作為PCR技術的延伸，RAPD反應有其自身的特點，區別於常規的PCR反應：①無需專門設計RAPD擴增反應的引物，隨機設計的長度9～10個堿基的脫氧核糖核苷酸序列均可運用。但是，為了保證退火反應時雙鏈的穩定性，G+C含量應在40％以上。而常規的PCR反應，必須通過已知的序列設計特定的引物。②在每個RAPD反應中隻加入一個引物。通過一個引物在兩條DNA互補鏈上的隨機配對實現擴增。③在最初的反應周期中，退火溫度較低，一般為36℃左右。一方麵保證短核苷酸鏈引物與模板的穩定配對，另一方麵允許適當的錯誤配對，從而擴大引物在基因組DNA中配對的隨機性，提高對基因組DNA進行多態性分析的效率。
2.RAPD標記的技術流程
RAPD標記的分析流程包括4個基本的步驟：①基因組的DNA抽提。②差異性引物的篩選。③差異性引物對所有的待分析個體的重複擴增。④差異帶型（RAPDs）的記錄和分析。
(1)基因組的DNA抽提用於RAPD標記分析的模板對於基因組的DNA要求不高，所要求的DNA總量也比較少。對於中草藥的材料而言，材料的來源往往比較少，因此探討小量的DNA抽提方法十分重要。因此我們介紹一種小量快速的DNA抽提方法。
取中草藥材料（葉片）500mg，在液氮中研磨成粉末；然後在粉末為解凍的條件下轉入1.5mleppendorf管中並迅速加入600μl預熱的CTAB提取緩衝液[2％CTAB，Tris-HCl（pH8.0）100mmol/L，NaCl500mmol/L，EDTA20mmol/L，用前加1.5％（V：V）巰基乙醇]，充分混勻後60％保溫50min，離心取上清液；分別用等體積的酚：氯仿：異戊醇（V︰V︰V=25︰24︰1）和氯仿︰異戊醇（V︰V＝24︰1）處理，異丙醇沉澱DNA，風幹後溶於TE中；加入RNAase（10mg/m1）至終濃度50μl/ml，於37℃溫育50min，用等體積的酚︰氯仿︰異戊醇抽提1～2次，用冰凍的無水乙醇沉澱DNA，用70％乙醇洗鹽、風幹，溶於適量的TE中。抽提以後的DNA通過0.7％瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA質量，要求獲得的相對分子質量大於20kb。獲得的基因組DNA利用紫外分光光度計測定其濃度，﹣20℃保存備用。
(2)差異性引物的篩選最先用於RAPD分析的隨機引物主要來自於Operon公司。Operon公司的引物從OpA01-OpZ20共有520個引物，此外其他的生物公司也有現成的10堿基出售。從理論上講，10個堿基的隨機引物的數量可以達到410個（包括重複堿基序列在內），這些隨機引物可以十分方便地在各個生物公司進行合成。
獲得了不同的隨機引物以後，下一步就是以不同的生物個體DNA為模板進行初步篩選，通常PCR反應物組成為：40ngDNA，2mmol/LdNTPs2μ1，10pmol/L隨機引物1μl，15mmol/LMg2＋3μl，1單位Taq酶，10×Buffer2.5μl，用雙蒸水補足25μl。這些PCR反應物的組成可以在我們的實驗室以不同的植物包括中草藥植物DNA為模板，驗證該反應體係的有效性。
上述的PCR反應混合物按照以下的PCR反應程序進行擴增。PCR反應程序設計為：94℃3min，45℃1min，72℃2min，3個循環；94℃1min，40℃1min，72℃1min，38個循環；94℃1min，40℃1min，72℃10min，1個循環。PCR反應程序中複性溫度按照擴增的目的不同應該有所差異。在篩選不同差異性的引物過程中，通常的複性溫度比較低（36～40℃）。而為了獲得較高的重複性，通常將複性的溫度提高到40℃以上。
(3)差異性引物對所有的待分析個體的重複擴增在以代表性材料（來源或者分類上差異最大的一些材料，以及親緣關係十分相近的材料）的DNA作為模板進行PCR以後，具有RAPDs引物可以作為差異性的引物用於分析所有的待測材料。有關的PCR分析的組分和程序采用下述的步驟。
(4)差異帶型（RAPDs）的記錄和分析分別從所有材料的PCR反應產物（25μ1）中，取其中的10μ1加上溴酚藍經1.2％瓊脂糖凝膠電泳4～5h，EB染色就可以顯示不同的差異帶型。記錄RAPD的方法可以利用照相記錄，也可以利用有關的掃描程序記錄觀察結果。有關的掃描程序在不同的生物公司的出售凝膠成像係統中都已經配備。
與RFLP相比，RAPD標記有如下幾個特點。①合成一套隨機引物可用於不同生物基因組之間的RAPD分析，而RFLP標記具有一定的種屬特異性，並受可利用的探針種類及數目限製，不能廣泛使用；②RAPD標記分析大大減少了多態性分析的預備性工作，無需製備克隆、放射性同位素標記、Southern印跡和分子雜交等操作，而且使用的DNA量極少，理論上10ngDNABp可滿足各種RAPD分析的需要；③絕大部分的RAPD標記不能區分雜合型和純合型基因組的RAPD反應產物，因此是顯性標記；④RAPD為表型中型，每個RAPD標記都相當於基因組分析中的靶序列位點（sequencetaggedsites，STS）。
但是，RAPD也有不足的一麵，主要表現在：①穩定性差由於單鏈引物隨機結合在眾多反向重複序列上，因而每次得到的實驗結果不可能一致，解決辦法是對單鏈引物進行篩選，優化PCR條件。②高度的變異性，即使親緣關係非常近的物種間結果也有很大差異。③Tm低的隨機引物，易受到外界條件影響。如：反應體係Mg2＋濃度。④反應使用不同引物導致產物信號差異太大，無法進行分析。
3.與RAPD相似的其他分子標記
與RAPD標記類似的分子標記還有隨機引物PCR（arbitraryprimedPCR，AP-PCR）標記和DAF（DNAamplificationfingerprinting，DAF）標記。