2.變異重複序列的種類
根據重複變異單位的特點不同，這些變異重複序列可以分為3大類：以15～75個核苷酸為基本單元的串聯重複序列稱為小衛星（minisatellite），以2～6個核苷酸為基本單元的簡單串聯重複序列稱為微衛星（microsatellite），以及簡單序列重複（SSR）。小衛星和微衛星也常常稱作重複數可變串聯重複（VNTR）標記。VNTR標記產生的多態性是由同一位點上的串聯單元數量的不同而產生的。
3.分析方法VNTR標記的多態性分析方法通常有兩種。
(1)以PCR擴增技術為基礎的分析方法利用PCR進行擴增能夠快速鑒定不同個體座位之間的VNTR，所得PCR產物通過電泳以後就可以比較在不同的生物體之間的串聯重複序列長度變異。對於微衛星而言，微衛星序列常常比較短，利用PCR擴增可以獲得滿意的檢測效果。但是許多小衛星序列太長，無法PCR擴增獲得滿意的結果。因此，需要利用分子雜交技術進行檢測。
(2)利用分子雜交技術檢測衛星DNA多態性的分析方法該方法與RFLP的分析方法具有相同之處，主要是通過對基因組DNA的限製性酶切、瓊脂糖凝膠電泳、分子雜交後以重複序列探針來探測，確定由於重複單位數目所引起的酶切片段長度多態性。
利用小衛星中的重複單元作為雜交探針是獲得VNTR信息的最快捷的途徑。由於人、動物基因組中存在大量的小衛星標記，目前人類小衛星序列和噬菌體M13蛋白基因序列已成為研究小衛星的常用探針。這些探針與植物基因組有較高的同源性，因此可以用於植物基因組的小衛星研究。VNTR產生的豐富的DNA帶譜用於DNA指紋研究是非常有用的，但是由於帶譜複雜，分析比較困難，不太適合作圖研究。
標準的多位點探針已成功地用在不同的生物類群遺傳差異分析當中，每個DNA探針或者引物擴增以後可形成10～30條可見帶型。因而，小衛星DNA可以檢測到種群內大量的遺傳變異，特別適於種群內個體鑒定及非親緣關係的排除。
單位點小衛星DNA在種群內及種群間都具有極高的多態性，可檢測到30～50個不同的等位基因。通過設計相應的引物，利用PCR擴增目標區域，然後通過聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析微衛星位點，能分辨出僅相差兩個堿基對的等位基因。因而也用於個體鑒定及遺傳變異測定，其特異性探針不斷被開發出來。但是由於單位點小衛星DNA分析技術也牽涉到DNA文庫的構建、探針的篩選及其序列設計、分子雜交等複雜過程，因而在中草藥的研究中還沒有報道。
(三)SSR標記技術
微衛星DNA又叫做簡單序列重複（simplesequencerepeat，SSR），其串聯重複的核心序列為1～6bp，其中最常見是雙核苷酸重複，即(CA)n和(TG)n。每個微衛星DNA的核心序列結構相同，重複單位數目10～60個，其高度多態性主要來源於串聯數目的不同。
1.SSR標記的基本原理
根據微衛星序列兩端互補序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛星片段，由於核心序列串聯重複，基本重複單元由串聯重複的2個、4個或者6個堿基（如CA、CAAC、GGAACC）重複單位組成，重複次數一般為10～50，廣泛存在於真核生物的基因組中。由於每個基本單元重複次數的不同，從而形成SSR位點的多態性。SSR位點兩側一般是相對保守的單拷貝序列，因此可根據兩側序列設計一對特異引物來擴增SSR序列。SSR序列的擴增產物經過聚丙烯酰胺凝膠電泳，比較擴增帶的遷移距離，就可了解不同個體在某個SSR位點上的多態性。
從SSR分析過程中可以看到，檢測SSR標記的關鍵在於必須設計出一對特異的PCR引物。為此，必須事先了解SSR位點兩側的核苷酸序列，尋找其中的特異保守區。獲得SSR引物序列一般的過程是：首先建立一個DNA文庫，篩選鑒定含有微衛星DNA序列的克隆，然後對陽性克隆進行序列的分析鑒定，就可以獲得所需要的SSR序列。一旦開發出某種生物基因組全套的SSR引物，就獲得了豐富遺傳變異信息的DNA標記。利用這種方法獲得SSR標記引物往往成本比較高，並且費時、費力。
獲得SSR擴增引物序列的另外一種方法就是從數據庫搜索SSR序列。這種途徑可以省去構建基因文庫、雜交、測序等煩瑣的工作，但是這種方法獲得的SSR信息量往往不如構建基因組文庫多。對一般實驗室而言，隻需利用現成的SSR引物進行PCR擴增，即可以分析DNA的多態性。目前，在許多物種中已有大量現成的、商品化的SSR引物。
SSR標記的最大優點是具有大量的等位差異，多態性十分豐富。由於SSR具有按照孟德爾式分離、呈共顯性遺傳、在數量方麵沒有生物學上的限製、多態性高、實驗程序簡單等優點，所以自1989年SSR技術誕生以來，被廣泛應用於遺傳作圖、種質鑒定等分子遺傳研究的各個方麵。SSR標記由於具有操作簡便和穩定可靠等優點，有逐漸取代RFLP標記的趨勢。
利用SSR標記的不足之處是遺傳背景不清楚的基因組引物設計存在一定的困難。如果能夠利用近緣物種的已經開發出來的引物進行PCR擴增往往能取得較好的結果，所以微衛星DNA標記技術將越來越實用。
2.SSR標記的技術流程
SSR的檢測手段主要有兩種，一種是以分子雜交為基礎的分析技術，另外一種是以PCR技術為基礎的檢測手段。這兩種不同的分析手段也是根據SSR的不斷發展所建立起來的。
(1)利用分子雜交技術揭示SSR多態性其實驗流程包括：DNA分離與提純、限製性酶切割分析、電泳分離與印跡、分子雜交、數據分析等幾個步驟。以分子雜交為基礎的SSR分析流程與前麵提到的RFLP分析基本一樣，所不同的是SSR分析使用的探針是經過標記後的寡核苷酸分子探針，例如(GTG)5、(ACA)6、(CAT)6、(GACA)4、(GATA)4等不同的寡核苷酸分子。這些不同的寡核苷酸分子的探針在不同的物種的分布是有所差異的，但是大多數的SSR分子探針是可以人工合成的。
(2)利用PCR的手段揭示SSR多態性與利用分子雜交揭示SSR多態性不同，利用PCR的手段分析不同物種或者材料之間的SSR差異操作相對比較簡單。主要包括SSR特異引物設計、基因組DNA的抽提、PCR擴增、PCR產物的檢測、SSR帶型的分析等幾個基本的過程。
①首先根據不同物種的基因組設計SSR的引物，然後合成這些不同的SSR引物用於SSR多態性的分析。
②以不同的材料的總DNA為模板利用SSR引物進行PCR擴增
PCR反應物組成為：40ngDNA，2mmol/LdNTPs2μl，10pmol/L特異引物1μl，15mmol/LMg2+3μl，1UTaq酶，10×Buffer2.5μl，用雙蒸水補足25μl。其中用於擴增的dNTPs可以是放射性核素32P標記的Datp（dGTP/dCTP/dTFP），或者是熒光標記的4種不同的脫氧核糖核酸。PCR反應程序設計為：94℃3min，55℃1min，72℃2min，3個循環；94℃1min，40℃1min，72℃1min，38個循環；94℃1min，50℃1min，72℃10min，1個循環。根據引物的退火溫度不同，PCR反應的複性溫度有所變化。為了獲得比較高的可重複性，複性溫度可以高達65℃。
③PCR反應產物檢測PCR擴增完成以後有多種方法進行檢測分析。以高濃度（4％）的瓊脂糖凝膠為介質分離PCR擴增產物，PCR產物在電泳4～5h以後經過EB染色，就可以記錄觀察結果。另外一種檢測方法就是利用聚丙烯酰胺凝膠分離PCR產物。將PCR產物分離以後的聚丙烯酰胺凝膠直接在裝有X線片的暗匣子中進行曝光過夜。不同物種之間的SSR差異在X線片上就可以清晰地顯現出來。
(四)ISSR標記技術
ISSR（inter-simplesequencerepeat）是一種新型的分子標記，是由Zietkiewicz等於1994年創建的一種簡單序列重複區間擴增多態性分子標記。該技術檢測的是兩個SSR之間的一段短DNA序列上的多態性，它的生物學基礎仍然是基因組中存在的SSR。
ISSR標記根據真核生物中廣泛存在SSR的特點，設計出各種能與SSR序列結合的PCR引物，對兩個距離較近、方向相反的SSR序列之間的DNA區段進行擴增。用於ISSR-PCR擴增的引物長度通常為16～18個堿基，由1～4個堿基組成的串聯重複和幾個非重複的錨定堿基組成，從而保證了引物與基因組DNA中SSR的5′或3′末端結合，導致位於反向排列、間隔不太大的重複序列間的基因組區段進行PCR擴增。SSR在真核生物中的分布是非常普遍的，並且進化變異速度非常快，因而錨定引物的ISSR-PCR可以檢測基因組許多位點的差異。
有時為了增加多態性，常常采用一個SSR序列和一個隨機引物組成的引物對，這樣就又獲得了另一種與SSR相關的標記。這種ISSR標記的一端可以錨定在SSR序列中，另一端則可以通過隨機引物來篩選，同一個SSR序列引物與不同的隨機引物組合，可以獲得各種各樣的組合，從而得到更多的多態性。
為了增加擴增產物的可靠性，一般在引物的5′或3′端接上2～4個嘌呤或嘧啶堿基，以對具有相同重複形式的許多SSR位點進行篩選，使得最終擴增出的ISSR片段不致太多。
ISSR標記呈孟德爾式遺傳，具有顯性或者共顯性特點。在動植物基因組中存在大量的2、4、6個核苷酸重複序列，因此，大多數ISSR標記所用PCR引物是基於雙核苷酸重複序列的。ISSR通常為顯性標記，呈孟德爾式遺傳，具有良好的穩定性和多態性，DNA用量少，技術要求低，成本低廉，並且PCR擴增時退火溫度一般維持在52℃左右，保證了PCR擴增的可重複性。
ISSR技術所用的PCR引物長度在20個核苷酸左右，與SSR不同的是不需要預先克隆和測序。近年來，ISSR標記技術已應用於植物遺傳分析的各個方麵，如品種鑒定、遺傳關係及遺傳多樣性分析、基因定位、植物基因組作圖研究等。