2.RFLP標記的技術流程
RFLP標記技術的基本流程概括起來包括以下的幾個基本步驟：基因組DNA的抽提、限製性酶切分析、分子雜交以及數據的分析統計等。
(1)基因組DNA的抽提植物基因組的DNA提取按照研究目的和研究材料已經發展了多種方法，包括CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法、SDS（十二烷基硫酸鈉）法、高鹽低pH法和樹脂提取法等多種方法。中草藥植物材料內，通常含有比較多的多糖、單寧、酚類等次生代謝物，這些物質會嚴重地幹擾DNA的抽取質量。此外，中草藥材料多為經過炮製以後的動植物器官或者組織，這些材料的DNA抽提相對比較困難。而RFLP分析要求的DNA量比較多，總量要求在10μg以上，並且要求純度比較高，因此尋找一種比較合適的DNA抽提的方法對於RFLP的分析就顯得十分重要。
CTAB法和SDS法的具體操作在目前的許多專著和教材中已有詳細描述，在此不再贅述。在此，介紹一種我們實驗中經常使用的經過修改後大量抽提基因組DNA的方法：改良的CTAB方法。這種方法既可以以幼嫩的葉片作為材料，也可以以其他的組織作為DNA提取的初始材料，其主要流程為：首先從田間試材的單株上取幼嫩的真葉（不超過5d）不經﹣70℃冷凍，立即進行DNA抽取。將所取葉片加液氮研磨成粉狀，然後將粉狀葉片裝入預冷凍的試管中，按10μg/ml樣品加入β-巰基乙醇。再按4ml/g加入預熱的DNA裂解液（2％w/vCTAB，1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl，0.02mol/LNa2-EDTA，pH8.0，2.0％PVP360）迅速攪拌均勻，60％水浴20～30min，中間輕搖數次。水浴完畢後，再加入等體積的氯仿︰異戊醇（24︰1），慢慢混勻，8000r/min離心15min，重複抽取至上清液清亮。取上清液加入0.6倍體積的異丙醇，慢慢混勻20～30次至DNA沉澱，鉤出沉澱的DNA。沉澱的DNA於76％乙醇中浸泡過夜，中間換洗幾次至DNA成白色絮狀。取出DNA在管壁擠幹，風幹後溶於2～5ml的TE（10mmol/LTris-HCl，0.1mmol/LNa2-EDTA，pH8.0）再加入10mg/mlRNAase2～5ml，37℃保溫1h，然後用等體積氯仿︰異戊醇（24︰1）抽取2次，加0.1倍體積的3mol/LNaAc（pH5.2）和2倍體積的冰凍無水乙醇沉澱DNA，用75％乙醇洗去鹽分，風幹，溶於適當體積的TE緩衝液中。
(2)限製性酶切分析取檢測效果較好的總DNA30～40μl約10μg（每次吸取DNA時最好切去取樣槍頭尖端），將試管進行編號。取所需的限製性內切酶50～80單位，加入到準備好的DNA中，在記載本上注明內切酶的種類。加人每種內切酶指定的反應緩衝液5μl，然後加入無菌水至終體積為50μl。將試管置於37％水浴中進行酶切，在酶切過程中要及時地用離心機將懸浮在管壁上的溶液離心至試管底部。酶切時間一般為18～24h，在酶切12h後，取2μl電泳檢測酶切效果。
製備0.8％瓊脂糖凝膠，在酶切充分的總DNA中加入5μl溴酚藍，混勻以後一起加入到點樣孔中，記錄樣品的點樣順序及相對分子質量標記位置。電泳時，先使用100V電壓使樣品跑出點樣孔，然後在20～30V的電壓下進行電泳12～14h。電泳完畢以後，將凝膠放入EB（EtBr）溶液中染色15min，紫外光下檢測電泳效果後再用蒸餾水漂洗15min。
(3)Southern分子雜交用解剖刀對凝膠進行修整，測量凝膠的長寬，以確定尼龍膜和吸水紙的大小，同時切去右下或右上邊沿用作標記。用蒸餾水漂洗2次後，對凝膠進行酸變性和堿變性。將疑膠置於0.25mol/L的HCl溶液中進行酸變性直至溴酚藍的顏色由藍色變成黃色為止，倒掉鹽酸，用蒸餾水衝洗。將凝膠置於0.4mol/LNaOH和0.6mol/LNaCl溶液中，堿變性30min，每隔幾分鍾輕輕搖動瓷盤，倒掉堿液，蒸餾水衝洗。將凝膠放人盛有0.5mol/LTris-HCl（pH7.5），1.5mol/LNaCl溶液中，中和30min，蒸餾水衝洗。
①Southern轉移準備大小與凝膠一致的Whatman紙、吸水紙、尼龍膜（在左下角注明每張膜的編號），在瓷盤中加入25mmol/L（pH6.5）磷酸鈉緩衝液1L。先將玻璃板置於瓷盤上，然後將Whatman紙均勻地鋪在玻璃板上，計2層，每一層都要用玻璃棒趕出氣泡。用塑料板將凝膠轉移到玻璃板上（注意保持平衡）。在轉移過程中，用一塊塑料板放置在凝膠上，另一塊塑料板放置在凝膠的下麵，捏緊上下塑料板，顛倒即可。將凝膠均勻地放置在吸水紙的中央，並用玻璃棒趕出氣泡。將尼龍膜均勻地置於凝膠上，趕出氣泡。尼龍膜上放置2層吸水紙，方法同搭橋，四周用X線片壓緊，上置玻璃板，壓500g重物，Southern轉移12～48h。
②DNA在尼龍膜上的固定轉移結束後取下玻璃板及紙巾，取出尼龍膜，放人2×SSC中，浸泡20min。取出尼龍膜用吸水紙吸出多餘的水分，風幹30min。用Whatman吸水紙包好，放人85～90℃的烘箱中烘幹2h，隨時注意觀察烘箱溫度。將烘好的尼龍膜用保鮮膜包好，放入﹣4℃的冰箱中備用。
③探針標記按照每200cm2尼龍膜加人100ng探針的用量，按不同的探針濃度取所需體積的探針和相對分子質量標記DNA（λDNA/HindⅢ)，按照以下的反應體係進行探針標記。探針標記前將探針在100℃沸水中水浴10min，再將其放人冰上10min，使探針充分變性。標記體係為：充分變性DNA5～15μl，dNTPs（dATP，dTTP，dGTP）6μ1，Klenowfragment2U，DNA聚合酶I大片段標記緩衝液5μl，6～10個堿基隨機引物4μl，加入無菌水補足50μl體係，迅速混勻後離心。按照每個試管2μl加32P標記放射性核素，靜置5h使DNA充分標記。加入等體積的TE（pH8.0）停止反應，加入500μl變性液（預雜交液）停止標記。將充分標記後的探針變性後備用。
④DNA預雜交和分子雜交預雜交前用2×SSC浸泡尼龍膜10min，用ddH20衝洗雜交管，在65℃時烘幹雜交管1～2h。按25ml／管配製預雜交液，在配製過程中要加熱使SDS溶解至透明，單鏈DNA在100℃沸水浴10min後立即放到0℃冰浴10min，使DNA由雙鏈變性成單鏈。將尼龍膜放入到雜交管中，加入雜交液，擰緊管蓋，防止預雜交液滲漏，65℃情況下新轉移的雜交膜預雜交6h，已經雜交後的舊尼龍膜隻需要預雜交5h。30min後觀察雜交管有無雜交液滲漏。
盡量倒出雜交管中的預雜交液，按每管5～10ml的標準加入雜交液，擰緊雜交管蓋，避免出現漏液現象。加入放射性核素標記的探針，顛倒雜交管若幹次，使探針與雜交液混合均勻。在65℃條件下雜交16～24h。注意在加入探針30min後注意觀察雜交管防止雜交管發生漏液現象。
⑤洗膜及壓片取出雜交膜，依次用以下配方進行洗膜（表9-2），洗膜時必須在搖動良好的搖床上進行，並不時翻動雜交膜，以免相互粘連或重疊。其中0.1×SSC，0.1％SDS預熱至65℃後加入。用保鮮膜包裹雜交膜，測定膜上放射性強度。在暗匣中依次放置增感前屏、雜交膜、X線片和增感後屏，在﹣70℃冰箱中自顯影7～10d後洗X線片。取出雜交膜後用吸水紙吸幹增感屏上的水分，風幹30min。
表9-2RFLP分析過程中洗膜時間和溶液配方
次數時間（min）溫度溶液體積/8張膜
25室溫2×SSC，0.1％SDS500ml
110室溫0.1×SSC，0.1％SDS500ml
2~43065℃0.1×SSC，0.1％SDS1L
⑥探針的去除撕掉包裹的保鮮膜，將膜浸入0.1×SSC，0.1％SDS溶液中，室溫下洗滌10min。將膜置於0.1mol/LNaOH，10％SDS溶液中變性4min。將膜置於0.2mol/LTris-HCI（pH7.5），0.1×SSC，0.2％SDS溶液（1L/8張膜）中和10min，洗膜結束以後，用吸水紙吸去水分，待測定放射性核素的含量以後用保鮮膜包好，置於4℃冰箱備用。
(4)數據的統計和分析將差異性的帶型轉換為數據0、1、2，其中0標記該帶型缺失，1表示具有該差異性帶型，2表示帶型為共顯性。這些不同個體的RFLPs可以形成數據矩陣，然後利用各種統計軟件就可分析不同的生物體之間的遺傳關係，或者進行基因定位。
RFLP標記是生物體之間分子水平變異的反映，不受顯隱性關係、發育階段和環境條件的影響，具有穩定遺傳和特異性的特點，這些優點都是同工酶標記所無法比擬的。同時，RFLP標記比同工酶標記數量多，並且具有共顯性、信息完整、重複性和穩定性好等諸多優點，可產生和獲得更多反映種、屬遺傳差異的多態性信息，為研究種屬間甚至品種間的親緣關係以及開展基因定位等研究提供了很好的手段。但是RFLP技術也有著明顯的不足，其實驗操作過程比較複雜，需製備放射性探針和進行southern轉移及雜交，放射自顯影，因而費時、煩瑣、汙染大、對環境和人體造成不良影響；對DNA含量與純度要求高，多態性水平低，技術難度高，隻適應單/低拷貝；有種屬特異性，在實際應用中受到限製。
(二)VNTR標記技術
1.原理
VNTR，即數目可變的重複序列（variablenumberoftandemrepeat，VNTR）。VNTR是1980年Wyman和White等人在研究人類的基因組文庫時首先發現的，被稱之為高可變的重複區。VNTR散布在基因組的不同位置，通常是基因組中的非編碼區，由串聯重複的短小序列組成，每個位點的大量重複單位具有豐富的變異。許多生物體特別是真核生物的DNA存在含有大量的串聯重複序列的高變異區。