正文 酶免疫技術在食品檢測中的應用(3 / 3)

商品ELISA試劑盒中應包含包被好的固相載體、酶結合物底物和洗滌液等。先進的試劑盒不僅提供全部試劑成分,而且所有試劑均已配製成應用液,並在各種試劑中加色素,使之呈現不同的顏色。ELISA操作步驟多,所需試劑也多,這種有色試劑既方便操作又有利於減少操作錯誤。ELISA所有儀器除定量測定中必需的出色儀(專用的稱為ELISA測讀儀)外,洗滌板也極有用。洗滌機的使用不僅省時省工,而且也利於操作標準化,對中小型實驗室是實用且易於接受的。但應注意在采用洗板機前,應先對洗板機的性能加以檢定,確認各孔的洗滌效果是否徹底,且重複性好。

半自動和自動化ELISA分析儀也趨成熟,並在大中型臨床檢驗實驗室中取得應用。自動化ELISA分析儀有開放係統(Opensystem)和封閉係統(Closesystem)兩類。前者適用於所有的96孔板的ELISA測定;後者隻與特定試劑配套使用。

(一)用於細菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生蟲的檢測

如沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、鏈球菌、結核分枝杆菌、布氏杆菌、金黃色葡萄球菌腸毒素、黃曲黴毒素等。肝炎病毒、風疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等;寄生蟲如弓形蟲、阿米巴、瘧原蟲等。

(二)用於蛋白質、激素、其他生理活性物質、藥物殘留、抗生素等的檢測

近年來,有關使用酶免疫法測定乳和血漿中有機化學殘留物已有報道,這標誌著本法在動物性食品衛生監測方麵具有新的應用趨勢。因其優點,該法已引起了世界各國的重視,並已著手這方麵的研究。但是,該法在動物性食品衛生監測中還存在著許多問題,不過,前景還是廣闊的。世界衛生組織(WHO)和世界糧農組織(FAO)對這方麵的研究給予了許多支持。隻要對實際問題進行細致的科學研究並努力尋求改進的方法,酶免疫法定會以新的姿態在食品衛生監測領域出現。標準化、商品化的酶免疫試劑盒將會問世,也將給整個食品衛生事業帶來新的前景。

目前藥物殘留免疫分析技術主要分為兩大類:一為相對獨立的分析方法,即免疫測定法(Immuno Assays,IAs),如RIA、ELISA、固相免疫傳感器(Soindphase immunosensor)等;二是將免疫分析技術與常規理化分析技術聯用,如利用免疫分析的高選擇性作為理化測定技術中的淨化手段,典型的方式為免疫親和色譜(Immuno Affinity Chromatogrphy,IAC)。與常規的理化分析技術相比,免疫分析技術最突出的優點是操作簡單,速度快、分析成本低。以使用微量滴板的ELISA為例,免疫測定法取樣量小,前處理簡單、容量大,儀器化程度低,檢測奶與GC/MS或GC/ECD相似,可方便地達到ng/g~pg/g級,分析效率則為HPLC或GC的幾十倍。目前大部分抗生素已經建立了免疫測定法,如磺胺二甲基嘧啶、氯黴素、沙拉沙星、鏈黴素、四環素、莫能菌素等。

免疫分析能與其他技術聯用。在聯用方法中,免疫分析技術既可作為HPLC或GC等測定技術的樣品淨化或分離手段,如IAC/HPLIAC/GC、HOIAC/HPLC;也可作為其離線或在線檢測方法,如HPLC/IA、TLC/IA、CZE/IA、SFC/IA、FIA/IA等,這些方法結合了免疫分析的選擇性、靈敏度與HPLC、GC等技術的高速、高效分離和準確檢測能力,使分析過程簡化、分析成本下降,拓展了待測物範圍。在HPLCIA等分析中,IA一般作為離線檢測方法;又稱免疫圖譜法(Immunograms),適用於液相檢測器無響應或分離困難的殘留組分的檢測。FIAIA可以實現IA的動態、實時和自動檢測,分析速度快,已發展為一種專門的免疫測定技術——FIIA。

ELISA試劑盒是目前奶牛場和牛奶公司使用最廣泛、快速、靈敏的檢測抗生素殘留的方法。各類抗生素試劑盒為國外生產,這使得國內的奶及奶製品公司花費較大。如德國拜發公司生產的抗生素檢測試劑盒,一個96次檢測試劑盒要花3800元,每個樣品的檢測要花30~50元。對一家中小型奶製品企業而言,每年在抗生素等藥物的檢測上要花費20萬元以上。因此很有必要研製和開發出國產的試劑盒,以降低成本,提高經濟效益。

(三)應用實例

以ELISA法檢測致瀉性大腸埃希氏菌腸毒素為例,說明ELISA在食品檢驗中的應用

(1)產毒培養將菌株和陽性及陰性對照菌株分別接種於0.6mL CAYE培養基內,37℃振蕩培養過夜。加入20 000IU/mL的多粘菌素B 0.05mL,於37℃,離心1h,分離上清液,加入0.1%硫柳汞0.05mL,於4℃保存待用。

(2)LT檢驗方法(雙抗體夾心法)

①包被:先在產腸毒素大腸埃希氏菌LT和ST酶標診斷試劑盒中取出包被用LT抗體管,加入包被液0.5mL,混勻後全部吸出於3.6mL包被液中混勻,以每孔100μL量加入到40孔聚苯乙烯硬反應板中,第一孔留空作對照,於4℃冰箱濕盒中過夜。

②洗板:將板中溶液甩去,用洗滌液Ⅰ洗3次,甩盡液體,翻轉反應板,在吸水紙上拍打,去盡孔中殘留液體。

③封閉:每孔加100μL封閉液,於37℃水浴中1h。

④洗板:用洗滌液Ⅱ洗3次,操作同上。

⑤加樣品:每孔分別加各種試驗菌株產毒培養液100μL,37℃水浴中1h。

⑥洗板:用洗滌液Ⅱ洗3次,操作同上。

⑦加酶標抗體:先在酶標LT抗體管中加0.5mL稀釋液,混勻後全部吸出於3.6mL稀釋液中混勻,每孔加100μL,37℃水浴中1h。

⑧洗板:用洗滌液Ⅱ洗3次,操作同上。

⑨酶底物反應:每孔(包括第一孔)各加基質液100μL,室溫下避光作用5~10min,加入終止液50μL。

⑩結果判定:以酶標儀在波長492nm下測定吸光度OD值,待測標本OD值大於3倍以上為陽性,目測顏色為橘黃色或明顯高於陰性對照為陽性。

(3)ST檢測方法(抗原競爭法)

①包被:先在包被用ST抗原管中加0.5mL包被液,混勻後全部吸出於1.6mL包被液中混勻,以每孔50μL加入於40孔聚苯乙烯軟反應板中。加液後輕輕敲板,使液體布滿孔底。第一孔留空作對照,置4℃冰箱濕盒中過夜。

②洗板:用洗滌液Ⅰ洗3次,操作同上。

③封閉:每孔分別加100μL封閉液,37℃水浴1h。

④洗板:用洗滌液Ⅱ洗3次,操作同上。

⑤加樣品及ST單克隆抗體:每孔分別加各實驗菌株產毒培養液50μL,稀釋的單克隆抗體50μL(先在ST單克隆抗體管中加0.5mL稀釋液,混勻後全部吸出於1.6mL稀釋液中,混勻備用),37℃水浴1h。

⑥洗板:用洗滌液Ⅱ洗3次,操作同上。

⑦加酶標記兔抗鼠Ig複合物:先在加酶標記兔抗鼠Ig複合物管中加0.5mL稀釋液,混勻後全部吸出於3.6mL稀釋液中混勻,每孔加100μL,37℃水浴1h。

⑧洗板:用洗滌液Ⅱ洗3次,操作同上。

⑨酶底物反應:每孔(包括第一孔)各加基質液100μL,室溫下避光5~10min,再加入終止液50μL。

⑩結果判定:以酶標記儀在波長492nm下測定吸光度(OD)值:

陰性對照OD值-待測樣本OD值陰性對照OD值×100%≥50%為陽性

目測無色或明顯淡於陰性為陽性。