良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由於配料的不同和製作工藝的差別，各種產品的質量差異很大。因此每一批號的聚苯乙烯製品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/mL）包被ELISA板各孔後，每孔內加入適當稀釋的酶標抗人IgG抗體，保溫後洗滌，加底物顯色，終止酶反應後分別測每孔溶液的吸光度。控製反應條件，使各讀數在0.8左右。計算所有讀數的平均值，所有單個讀數與平均讀數之差應小於10％。與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特點為質軟、板薄、可切割、價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時也略高。
除塑料製品外，固相酶免疫測定的載體還有兩種材料。一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等。另一種載體是以含鐵的磁性微粒製作的，反應時固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應的速率，反應結束後用磁鐵吸引作為分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀器。
六、最適工作濃度的選擇
在建立ELISA測定中，應對包被抗原或抗體的濃度和酶標抗原或抗體的濃度予以選擇，以達到最合適的測定條件和節省測定費用。下麵以夾心法測抗原為例，介紹最適工作濃度的選擇方法。
在夾心法ELISA中可用棋盤滴定法同時選擇包被抗體和酶標抗體的工作濃度，舉例如下。
（1）抗體免疫球蛋白用包被緩衝液稀釋至蛋白質量濃度為10，1，0.1μg/mL，分別在ELISA板上進行包被，每一濃度包括三個縱行，包被完成後進行洗滌。
（2）在一個橫行各包被孔中加入強陽性抗原液，另一橫行加入弱陽性抗原液，第三橫行加入陰性對照液，保溫，洗滌。
（3）將酶標抗體用稀釋液稀釋成三個濃度，例如1∶1000、1∶5000和1∶25000。分別加入每一包被濃度的一個縱行中，保溫，洗滌。
（4）加底物顯色。加酸終止反應後，讀取A值。
（5）以強陽性抗原的A值在0.8左右、陰性參考的A值小於0.1的條件作最適條件，據此選擇包被抗體和酶標抗體的工作濃度。從表14-2可看出包被抗體濃度可選用1μg/mL，酶標抗體的稀釋度可選為1∶5000。為了進一步節省試劑，可以此濃度為基點，縮小間距再做進一步的棋盤滴定。
七、ELISA測定方法
要使ELISA測定得到準確的結果，不論是定性的還是定量的，必須嚴格按照規定的方法製備試劑和實施測定。主要試劑的製備要點已如前述，其他一般性試劑，如包被緩衝液、洗滌液、標本稀釋液、結合物稀釋液、底物工作液和酶反應終止液等，配製時不可掉以輕心。緩衝液可於冰箱中短期保存，使用前應觀察是否變質。蒸餾水的質量在ELISA中也至關重要，最好使用新鮮重蒸餾的。不合格的蒸餾水可使空白值升高。
測定的實施中，應力求各個步驟操作的標準化，下麵以板式ELISA為例，介紹有關注意事項。
（一）加樣
在ELISA中除了包被外，一般需進行4～5次加樣。在定性測定中有時不強調加樣量的準確性，例如規定為加樣一滴。此時應該使用相同口徑的滴管，保持準確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中則加樣量應力求準確。標本和結合物的稀釋液應按規定配製。加樣時應將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，並注意不可出現氣泡。
（二）保溫
ELISA中一般有二次抗原抗體反應，即加標本後和加結合物後，此時反應的溫度和時間應按規定的要求，保溫容器最好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各ELISA板不應疊在一起。為避免蒸發，板上應加蓋，或將板平放在底部墊有濕紗布的濕盒中。濕盒應該是金屬的，傳熱容易。如用保溫箱，空濕盒應預先放在其中，以平衡溫度，這在室溫較低時更為重要。加入底物後，反應的時間和溫度通常不做嚴格要求。如室溫高於20℃，ELISA板可避光放在實驗台上，以便不時觀察，待對照管顯色適當時，即可終止酶反應。
（三）洗滌
洗滌在ELISA過程中不是反應步驟，但卻是決定實驗成敗的關鍵。洗滌的目的是洗去反應液中沒有與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性吸附於固相載體的幹擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附作用是普遍性的，因此在ELISA測定的反應過程中，應盡量避免非特異性吸附，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的幹擾物質洗滌下來。在標本和結合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐溫，Tween）一類物質，即可達到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表麵張力物質，常作為助溶劑。根據脂肪酸的種類而對聚山梨酯編號，結合月桂酸的為聚山梨酯20，在ELISA中最為常用。它的洗滌效果好，並具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結合的作用。
洗滌如不徹底，特別在最後一次，如有酶結合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標本內的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗淨，也將與酶標抗體作用而產生幹擾。
ELISA板的洗滌一般可采用以下方法：①吸幹孔內反應液；②將洗滌液注滿板孔；③放置2min，略作搖動；④吸幹孔內液，也可傾去液體後在吸水紙上拍幹。洗滌的次數一般為3～4次，有時甚至需洗5～6次。
（四）比色
ELISA實驗結果可用肉眼觀察，也可用酶標儀測定。肉眼觀察也有一定準確性。將凹孔板置於白色背景上，用肉眼觀測結果。每批實驗都需要陽性和陰性對照，如顏色反應超過陰性對照，即判斷為陽性。如用不同稀釋度的標本做實驗，也可獲得滴度。欲獲精確實驗結果，需用酶標儀來測量光密度。所用波長隨底物而異。國內外生產的酶標儀價格從幾千元到幾萬元不等，有人工檢測機器打印結果的，也有全自動檢測的，另外，還有自動化洗板設備。
（五）結果判定
（1）用“+”或“-”表示超過規定吸收值（0.2～0.4）的標本均屬陽性，此規定的吸收值是根據事先測定大量陰性標本取得的，是陰性標本的均值加兩個標準差。
（2）直接以吸收值表示吸收值越大，陽性反應越強，此數值是固定實驗條件下得到的結果，而且每次都伴有參考標本。
（3）以終點滴度表示將標本稀釋，最高稀釋度仍出現陽性反應(即吸收值仍大於規定吸收值時)，為該標本的滴度。
（4）以P/N表示求出該標本的吸收值與一組陰性標本吸收值的比值，大於1.5倍、2倍或3倍，即判為陽性。
八、酶免疫技術在食品檢驗中的應用
目前食品受農藥、獸藥汙染的問題仍比較嚴重，給人們的身體健康帶來了危害，盡管國家和政府對此已做了大量的工作，投入了人力、物力，但執行情況仍不盡如人意。其主要原因之一就是缺乏快速、靈敏、簡便的檢測方法，相關的檢測試劑研發速度太慢。免疫分析技術如酶聯免疫分析法、膠體全免疫層析試紙法是一種快速、靈敏、簡便的分析方法，在國外已被用於食品安全檢測，我國也已在臨床檢驗中應用多年。
酶免疫測定具有高度的敏感性和特異性，幾乎所有的可溶性抗原抗體係統均可用以檢測。它的最小可測值達ng甚至pg水平。與放射免疫分析相比，酶免疫測定的優點是標記試劑比較穩定，且無放射性危害。因此，酶免疫測定的應用日新月異，酶免疫測定的新方法、新技術不斷發展。但酶免疫測定在食品檢驗中的應用，應歸功於商品試劑盒和自動或半自動檢測儀器的問世。酶免疫測定步驟複雜，試劑製備困難。隻有用符合要求的試劑和標準化的操作，才能獲得滿意的結果。