正文 免疫熒光技術在食品檢測中的應用(3 / 3)

(3)熒光顯微鏡。

(4)溶液與試劑磷酸鹽緩衝生理鹽水:0.01m(pH 9.0)PBS-0.85%NaCl;固定液:按順序將無水乙醇60mL、三氯甲烷30mL混勻,再加入36%~38%甲醛10mL、混勻4℃儲存,重複使用次數以不超過三次為宜;pH 9.0碳酸鹽緩衝甘油:無水Na2CO3(相對分子質量105.99)6g、無水NaHCO3(84.01)37g溶於蒸餾水中,加至100mL,混勻,即成pH 9.0碳酸鹽緩衝液,以此一份加九份甘油混勻即成,4℃,不超過2周為宜;沙門氏菌多價熒光抗體試劑:選用經國家進出口商品檢驗局批準的以FITC標記的沙門氏菌A-67全價“OH”免疫球蛋白(或沙門氏菌A-60多價“OH”免疫球蛋白),染色時應按試劑所標明的常規染色工作濃度和稀釋方法進行稀釋後使用。稀釋後的熒光抗體試劑置4℃儲存可使用1個月左右,保持其固有的染色亮度不變。

(二)操作步驟

熒光抗體技術是利用已知的標記有熒光素的抗體來檢測相應抗原的一種特異、敏感的方法。它可直接用於細菌混雜培養物的檢驗,因而比常規的血清學方法優越。

本法對實驗中試樣製備、增菌培養方法、塗片、染色鏡檢及溶液試劑的配製、標記抗體的儲存和染色效價測定等各項都有嚴格規定,以盡量減少非特異性著染,避免造成失誤。其操作方法如下。

(1)試樣製備對規定的直接增菌培養的肉類樣品,可采用剪碎法或棉拭塗抹法而不宜用均質器打碎法,以免細微顆粒過多幹擾鏡檢效果。

(2)增菌培養試樣以SF或MM培養基增菌,培養18h左右。

(3)塗片、固定、染色

①以直徑為2mm的接種環取已接種的最後培養物1環,製成較薄的標本塗片,置於37℃溫箱或室溫完全晾幹後,用乙醇-三氯甲烷-甲醛固定液固定5~10min,再用95%乙醇浸洗後晾幹(此乙醇以不重複利用三次為宜)。

②將沙門氏菌A-67全價“OH”免疫球蛋白試劑(染色工作濃度)滴加於各標本塗片上,置濕盒內經37℃、30min後取出,用0.01molL、pH 9.0PBS衝去多餘的熒光抗體,另換相同的PBS浸洗10min,再以蒸餾水衝洗後晾幹。

③滴加pH 9.0碳酸鹽緩衝甘油後,加蓋玻片。

(4)鏡檢先以低倍鏡後以高倍鏡觀察,記錄染色亮度與菌量情況等封片。

①菌體熒光染色亮度評定標準

++++:黃綠色閃亮熒光,菌體周圍及中心輪廓清晰

+++:黃綠色明亮熒光,菌體周圍及中心輪廓清晰

++:黃綠色熒光較弱,周圍及中心輪廓清晰

+:僅有暗淡的熒光,菌形尚可見

-:無熒光,或菌形不清

②結果判定

陽性:菌體熒光亮度達到++~+++,菌體形態特征符合沙門氏菌,多數視野中均能檢出數個菌體以上。

疑似陽性:a.菌形符合,熒光亮度在++以上,但單位視野中菌量過少或僅個別視野見到有部分菌體聚集現象;b.熒光亮度在++以上,但菌體熒光不完整或形態不典型;c.菌形符合,熒光亮度在+~++,但菌量較多且分布較均勻。

陰性:熒光亮度在++以下,且不屬於疑似陽性範圍者,均為陰性。

(三)報告

(1)鏡檢陰性報告為“未檢出沙門氏菌”,或“未檢出亞利桑那菌”或“未檢出沙門氏菌和亞利桑那菌”。

(2)鏡檢陽性按ZB-8-83《出口食品沙門氏菌(包括亞利桑那菌)檢驗方法》繼續進行培養檢查,並根據結果作出報告。若培養法與熒光法結果不一致,應以原增菌液重新進行純分離培養檢查,並根據該結果報告。

(3)鏡檢疑似陽性以原增菌液重新塗片、染色、鏡檢,如仍不能確定時,同樣以原增菌液按原方法繼續培養檢查,並根據培養法檢查結果作出報告。