抗體工作濃度的確定方法是將熒光抗體自1∶（4～256）倍比稀釋，對切片標本作熒光抗體染色。以能清晰顯示特異熒光、且非特異染色弱的最高稀釋度為熒光抗體工作濃度。
熒光抗體的保存應注意防止抗體失活和防止熒光淬滅。最好小量分裝，－20℃凍存，這樣就可放置3～4年；在4℃中一般也可存放1～2年。
三、標本的製作
食品衛生檢驗中，熒光標記抗體檢測標本的製作方法是將樣品增菌液塗在載玻片上，塗片應薄而均勻，幹燥後用化學方法固定，然後進行熒光染色。固定的目的有兩個，一是防止被檢材料從玻片上脫落，二是消除抑製抗原抗體反應的因素，如脂肪之類。最常用的固定劑為丙酮和95％的乙醇。經丙酮固定後，許多病毒、細菌的定位研究常能得到良好的結果。乙醇對可溶性蛋白抗原的定位也較好。8%~10％福爾馬林較適合於脂多糖抗原，因為這類抗原可溶於有機溶劑。固定的溫度和時間要憑經驗確定，一般用37℃10min。室溫15min或4℃30min。某些病毒最好以丙酮-40～-20℃，固定30min。固定後應隨即用PBS反複衝洗，幹後即可用於染色。
四、熒光抗體染色方法
（一）直接法
這是熒光抗體技術最簡單和基本的方法。滴加熒光抗體於待檢標本片上，經反應和洗滌後在熒光顯微鏡下觀察。標本中如有相應抗原存在，即與熒光抗體特異結合，在鏡下可見有熒光的抗原抗體複合物。此法的優點是操作簡單、特異性高。
（二）間接法
根據抗球蛋白試驗的原理，用熒光素標記抗球蛋白抗體(簡稱標記抗抗體)的方法。檢測過程分為兩步：第一，將待測抗體(第一抗體)加在含有已知抗原的標本片上作用一定時間，洗去未結合的抗體；第二，滴加標記抗抗體。如果第一步中的抗原抗體已發生結合，此時加入的標記抗體就和已固定在抗原上的抗體(一抗)分子結合，形成抗原-抗體-標記抗抗體複合物，並顯示特異熒光。此法的優點是敏感性高於直接法，而且無需製備熒光素標記的抗球蛋白抗體，就可用於檢測同種動物的多種抗原抗體係統，也可用熒光素標記葡萄球菌A蛋白。代替標記抗球蛋白抗體用於間接法熒光染色，且不受第一抗體來源的種屬限製，但敏感性低於標記抗抗體法。間接法有時易產生非特異性熒光，為其缺點。此法常用於各種自身抗體的檢測，如果第一抗體為已知，間接法也可用於鑒定未知抗原。
經熒光抗體染色的標本，需要在熒光顯微鏡下觀察。最好在染色當天即作鏡檢，以防熒光消退，影響結果。熒光顯微鏡檢查應在通風良好的暗室內進行。首先要選擇好光源或濾光片，濾光片的正確選擇是獲得良好熒光觀察效果的重要條件。在光源前麵的一組激發濾光片，其作用是提供合適的激發光。激發濾光片有兩種：MG為紫外光濾片，隻允許波長275～400nm的紫外光通過，最大透光度在365nm；BG為藍紫外光濾片，隻允許波長325～500nm的藍外光通過，最大透光度在410nm處。靠近目鏡的一組阻擋濾光片（又稱吸收濾光片或抑製濾光片）的作用是濾除激發光，隻允許熒光通過，透光範圍為410～650nm，代號有OG（橙黃色）和GG（淡綠黃色）兩種。觀察FITC標記物可選用激發濾光片BG12，配以吸收濾光片OG4或GG9。觀察RB200標記物時，可選用BG12與OG5配合。
六、在食品檢驗中的應用
免疫熒光檢測技術已經廣泛應用於醫藥衛生領域，可檢測細菌、病毒、寄生蟲等，在食品衛生領域也應用得越來越多，下麵以沙門氏菌的熒光抗體檢驗為例，說明免疫熒光抗體技術在食品檢驗中的應用。
（一）試驗器材及試劑
除沙門氏菌增菌所需物品外，另需如下材料。
（1）載玻片76mm×26mm，厚0.8～1.0mm，事先刻好4×2個小方格，並編號。先用洗滌劑徹底洗淨油汙，經滴定檢查證實無油汙，再浸於95%酒精中備用。
（2）蓋玻片22mm×22mm，厚0.13～0.17mm，同上洗淨，浸於95%酒精中備用。