在試圖減少檢測時間方麵,采用在緩衝蛋白腖水(BPW)中非選擇性增菌6h,然後進行細胞破碎和PCR,可在接受食品樣品後12h內完成檢測,並可檢測不同沙門氏菌血清型。試驗表明,在BPW中增菌8h後,方法的靈敏性不增加,這限定了最佳增菌時間為6h。增菌後,粗提、PCR、電泳共需5~6h,這樣可在12h內完成,相對需更長增菌時間的檢測方法來說縮短了時間。
二、PCR技術在益生菌檢測及鑒定中的應用
由於PCR技術可以快速特異地擴增任何期望的DNA片段和目的基因,因而在微生物的分子檢測和鑒定領域具有廣闊的應用前景,在食品級益生菌檢測方麵的研究也正逐步展開。
近十年,雙歧杆菌分子生物學研究進展迅速,尤其在雙歧杆菌遺傳轉化、基因克隆和表達係統等方麵,已有很多研究報道。隨著AFLP、RFLP、RAPD-PCR等DNA分子標記技術的發展,這些新技術在雙歧杆菌遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、種係發生研究中應用日益廣泛。
已有的研究比較了雙歧杆菌現有32個種及相關種的16S rRNA基因序列後,發現其1412~1432位的寡核苷酸減基序列(21個)在所有的雙歧杆菌中相同,能作為雙歧杆菌屬特異的寡核苷酸片段,可用其作為PCR的引物來擴增雙歧杆菌16S rRNA的基因片段。而模板DNA通過簡單的SDS裂解菌體細胞,而後用蛋白酶K去除蛋白即可獲得。在此條件下,所有的雙歧杆菌可由PCR擴增產生典型的1.35kb的核苷酸片段,而其他細胞不產生此帶,故用PCR技術能夠進行雙歧杆菌的檢測、鑒定及分類。
而RAPD-PCR擴增圖譜作為一種新的分子標記,具有個體特異性,國內已有研究用篩選的S256引物對9株7種雙歧杆菌進行擴增得到了多態性圖譜,從圖譜中找到了屬內種間共有條帶,以及種內株間共有條帶,同時也有在種水平和株水平上的特征性條帶,它們有望作為菌種和菌株鑒定的依據,RAPD圖譜具有作為工業益生菌菌株分子標記的潛力。
三、存在的問題及應用展望
PCR技術雖是一種快速、特異、靈敏、簡便、高效的檢測新技術,但其廣泛運用會受限於:①操作過程中樣品間的交叉汙染和極少量外源性DNA的汙染,都會對檢測結果產生很大影響;②從各種食品原料中高效率的DNA抽提方法有待於開發;③活菌和死菌不能區別;④容易受到食品基質、培養基成分的幹擾,殘留食物成分會抑製PCR酶反應;⑤引物的設計及PCR反應條件是影響特異性和敏感性的重要因素。在實際應用中也存在不少問題,汙染問題就是其中之一。由於PCR是一種極為靈敏的反應,一旦有極少量外源性DNA汙染,就可能出現假陽性結果;此外,各種實驗條件控製不當,很容易導致產物突變;還有,引物的設計及靶序列的選擇不當等都可能降低其靈敏度和特異性。因而,實驗室操作的規範化在PCR技術中是極其重要的。但由於其快速、特異、敏感的特點,PCR技術作為一種檢測手段仍有巨大的運用價值。而且隨著研究不斷深入,PCR檢測方法也會得以發展和改善,並將在食品微生物檢測中得到更多的應用。