反向PCR主要優點是簡單、快速，可以研究許多獨立的克隆。但也有其局限性：第一，由於旁側序列是未知的，故在選擇合適的限製性內切酶時，常需要用幾種酶做預試驗，或選擇幾種可以產生片段大小合適的酶；第二，許多常用的限製性內切酶不但在插入序列上有切點，同時在載體上不合適的位置也有切點。
六、增效PCR
PCR反應中引物濃度一般為0.1μmol/L。實驗證明，當模板數小於1000個拷貝，而引物濃度很高時，由於引物二聚體的形成及非特異產物競爭引物和酶，PCR產量會明顯減少。采用增敏PCR（booster PCR，BPCR）擴增模板量很低的樣品時，可明顯提高PCR產量。
這種方法的原理是：在適當稀釋的引物條件下，反應中引物相對碰撞機會減少，而利於引物與模板複性。但由於引物的減少會明顯影響待擴增序列的產量，因此需在擴增一定循環後再補加引物，於正常PCR條件下擴增，使產物呈指數增加。增敏PCR是分兩期進行的，第一期是在引物與模板均少的狀態下進行，引物濃度僅為每升數十皮摩爾，延長退火時間，進行15～20個循環。這一期擴增的主要目的是增加模板量，有效地防止第二期擴增時加入過多引物間的相互反應，阻止引物二聚體的形成。第二期中補加引物至0.1μmol/L，再於常規條件下進行20個循環。由此可見，增效PCR的第一期是為增加特異性，第二期是為增加特異靶序列產量而設計的。
七、RNA的聚合酶鏈反應
目前常用的RNA檢測方法有原位雜交、點雜交、Northern印跡雜交及核酸酶保護試驗等，這些方法的普遍缺點是難以檢測低豐度的mRNA，且操作繁瑣，將RNA反轉錄和PCR結合起來建立的RNA聚合酶鏈反應（RT-PCR），則可克服上述困難。RT-PCR先在反轉錄酶的作用下以mRNA為模板合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR反應，這樣低豐度的mRNA被擴增放大，易於檢測。RT-PCR是一種快速、簡便且敏感性極高的檢測RNA方法，運用此法可檢測單個細胞中少於10個拷貝的特異RNA。RT-PCR可應用於：①分析基因的轉錄產物；②克隆cDNA及合成cDNA探針、改造cDNA序列等。
RT-PCR中的關鍵步驟是RNA的反轉錄，要求RNA模板必須是完整的，且不含DNA、蛋白質等雜質。若RNA模板中汙染了微量DNA，擴增後會出現特異DNA的PCR產物，而cDNA擴增產物卻很少，必要時可用無RNase的DNase處理反轉錄產物，消除DNA後再進行PCR擴增。蛋白質未除淨可與RNA結合，從而影響反轉錄和PCR反應。
八、錨定PCR
人們經常要分析一端序列未知的基因片段，而一般的PCR必須預先知道欲擴增DNA片段兩側的序列，這就限製了PCR技術的應用。錨定PCR（anchored PCR，A-PCR）則可克服未知序列帶來的障礙。該法的基本原理是：在基因未知序列端添加同聚物尾，人為賦予未知基因末端序列信息，再用人工合成的與多聚尾互補的引物作為錨定引物，在與基因另一側配對的特異引物參與下，擴增帶有同聚物尾的序列。反應過程概括如下：①提取總RNA或mRNA，以mRNA為模板，在反轉錄酶作用下合成cDNA；②在DNA末端轉移酶作用下，在cDNA 3′端添加Poly dC尾；③加入與目的基因特異配對的引物作為3′端引物，錨定引物poly dC作為5′端引物，為了保證擴增特異性，錨定引物多核苷酸dC長度需大於12，同時為了克隆操作的方便，其5′端可增加限製性內切酶的識別位點或其他序列信息，PCR擴增出帶有Poly dC尾的cDNA序列。錨定PCR對分析未知序列基因有特殊價值。另外，當已知某蛋白質氨基端或羧基端氨基酸序列時，A-PCR還可用於從基因組DNA克隆該蛋白質的基因。