引物的設計及各對引物濃度的確定，對多重PCR的成功尤為重要，各個引物的3′端要避免互補，引物長度比一般PCR反應引物稍長，以22～30bp為宜。引物的濃度需根據具體實驗確定，加入終濃度為10%DMSO可提高反應的靈敏度。
四、不對稱PCR
不對稱PCR（asymmetric PCR）的目的是擴增產生特異長度的單鏈DNA。其原理為PCR反應中采用兩種不同濃度的引物，經若幹輪循環後，低濃度的引物被消耗盡，以後的循環隻產生高濃度引物的延伸產物，結果產生大量單鏈DNA。因PCR反應中使用的兩種引物濃度不同，因此稱為不對稱PCR，此法產生的單鏈DNA可用作雜交探針或DNA測序的模板。
進行不對稱PCR有兩種方法：①PCR反應開始時即采用不同濃度的引物；②進行二次PCR擴增，第一次PCR用等濃度的引物，以期獲得較多的目的DNA片段，提高不對稱PCR產率，取第一次擴增產物（含雙鏈PCR片段）用單引物進行第二次PCR擴增產生單鏈DNA。
圖11-3不對稱PCR擴增示意圖第一種方法的缺點是隻能用限定濃度的引物，大大地降低了PCR產率，此外，當引物缺乏、有遊離dNTP存在時，PCR的特異產物和非特異產物會相互引發新鏈的合成，降低反應的特異性。所以，不對稱PCR反應中，dNTP濃度應比標準PCR反應低。
第二種方法由於第一次擴增產生了大量的目的DNA，直接將目的DNA片段從瓊脂糖凝膠中回收，除去不需要的引物及非特異產物，用單引物進行第二次PCR擴增，此法可將單鏈DNA的產率提高達皮摩爾（pmol）。不足之處是二次分離步驟增加PCR汙染的幾率。為了克服上述方法的缺點，有人設計同一反應管中的不對稱PCR，即設計第3個引物，位於前一對引物內側，其tm值比前一對引物tm值高10℃，前若幹輪循環采用低溫退火，產生大量雙鏈DNA，後麵的循環高溫退火，隻有第3個引物可與模板結合、延伸，結果產生單鏈DNA。
五、反向PCR
對於已知序列的DNA片段，隻要設計合適的引物，常規PCR就可擴增位於兩個引物之間的DNA片段，但不能擴增引物外側的DNA。然而在分子生物學研究中，經常需要鑒定緊鄰已知順序的DNA片段，如編碼DNA的上遊及下遊區域、轉位因子插入位點等。在PCR技術出現以前，要測定已知基因兩側未知的序列是非常繁雜的。一般都需先用限製性內切酶進行消化，再用已知順序的側翼區段作為探針進行Southern雜交，來鑒定合適大小的末端片段，然後從製備性凝膠上純化這些片段，克隆到載體上，得到的重組子進一步與已知順序的側翼區探針雜交，以鑒定合適的克隆。為測定未知的側翼區順序，還常需亞克隆出各種片段。
反向PCR（inverse PCR，IPCR）可以擴增一個已知DNA片段的未知旁側序列，該方法的基礎是將側翼區DNA轉變成為引物內圍區域。其做法是首先用合適的限製性內切酶在已知DNA序列之外切割，再將形成的限製性DNA片段自身連接成環狀分子。所用的引物仍然和已知序列兩端順序同源，不同的是它們的3′端方向轉向側翼區的未知DNA序列。經過一般的PCR擴增之後，其產物就是該環狀分子中未知序列的DNA片段。也可將環化DNA線性化後再進行PCR擴增，有報道認為，用線性化DNA進行IPCR擴增，效率可提高100倍。
限製性內切酶的選擇對IPCR很重要，將已知的DNA序列稱做核心DNA，第一步消化基因組DNA模板時，必須選擇核心DNA上無酶切位點的限製性內切酶，若產生黏性末端DNA片段則更易於環化。此外，限製性內切酶消化後產生的DNA片段大小要適當，太短（＜200～300bp）則不能環化，太長的DNA片段則受PCR本身擴增片段有效長度的限製。