正文 定性與定量分析(3 / 3)

某一樣本有n個組分,在l(l>n)個波長點上測得其吸光度值,根據比爾定律及吸光度的加和性。

(二)計算分光光度法測定多組分的實驗方法

1.摩爾吸收係數矩陣ε的求解

求ε矩陣通常用單一組分標準溶液法及混合組分準樣溶液法。

(1)單一組分標準溶液法即配製混合物的各組分的單一純品溶液(組分濃度與待測樣品該組分濃度相近),在l個波長點上測純組分的吸光度,由比爾定律A=εc便能換算出對應波長的摩爾吸收係數ε,再由各組分各波長的ε值,便可組成摩爾吸收係數ε矩陣。 這種方法雖然簡單,但實驗的偶然誤差會導致測量結果的精度不高,因此不是理想的方法。

(2)混合組分標準樣溶液法配製m(m>n)個各組分濃度組合不同的混合標準溶液,得到濃度矩陣cn×m,在l個波長點上分別測量它們的吸光度,得到吸光度矩陣Al×m,便可用根據比爾定律及矩陣算法可推出求解ε的公式:

ε=AcT(ccT)-1

通過式已知的濃度矩陣cn×m和吸光度矩陣Al×m,可求出摩爾吸收係數矩陣εl×n。

2.混合標準溶液的配製

在計算分光光度法的諸方法中均要用到混合標準溶液,應使m個混合標準溶液具有代表性和覆蓋性,因而在具體配製安排中應注意如下幾點。

(1)混合標準溶液的個數m≥(2~3)n(n為組分數),若能保證精度,m可選擇小些以減少工作量。為使各組分濃度配製得均勻、分散、整齊、可比,可用正交試驗設計法安排。

(2)混合標準溶液各組分的濃度水平的上下限,應比實際樣品濃度變化範圍寬。如樣品濃度允許的變化範圍為其平均值的80%~120%,則濃度水平的上下限可定為平均值的130%和70%;組分濃度的間隔小一些會提高均勻性。但如果間隔過小(如濃度間隔在0.01mg/L以下),水平數過多,實際操作難以控製,試驗結果反而不好,這時可以不減少試驗次數(即混合標準個數),采用擬水平辦法縮小水平數。

(3)混合標準溶液組分的平均濃度應靠近待測樣品組分的濃度,含量最高的混合標準溶液吸光度值應落在吸光度的線性範圍,一般其吸光度值A≤1.0較好。

3.檢測波長位置的選擇

在同時測定多組分的計算分光光度法的應用中,選擇恰當的測定波長的位置,對改善檢測結果也很重要,一般應遵從如下原則。

(1)各組分吸光度在該波長處加和性良好。

(2)波長點盡可能包含各組分的特征峰。

(3)波長點應選在組分吸收曲線的峰頂處,或混合物吸收曲線的頂部較為平坦處,不應選在曲線上升(或下降)的陡部。

(4)不同的波長點應突出某個組分的較大的吸收係數,而不應同時突出兩個組分的較大的吸收係數,以保證求逆矩陣時計算誤差較小。

不同的計算分光光度分析方法對上述諸點的苛求程度不同,但對於測定波長點數較少時應注意盡量滿足,以提高測量的準確度。

(三)幾種計算分光光度分析法簡介

現將文獻中報道的七種多組分同時測定方法的原理、特點和適應範圍做一簡介。

1.AKC矩陣法

當式中測定波長個數l等於組分數n時,求解各組分濃度的方法,稱為AKC矩陣法。該法就是經典的線性方程組法。隻要知道ε矩陣,測定待測樣本n個波長上的吸光度值便能通過一次求逆求出n個組分的濃度,此法比較簡單,理論上適用於任意多組分體係的測定。但由於選擇波長點數少,而測量操作也必然存在誤差,所以如果某一波長位置選擇不當,方程為病態方程組時,測定誤差較大。AKC矩陣法隻適用於組分數較少的簡單體係的測量。

2.最小二乘法

當式中測量的波長個數l大於組分數n時,方程個數多於待求未知組分數,便組成矛盾方程組。根據殘差平方和最小原理而建立的多元線性擬合法求解多組分濃度的方法,稱為最小二乘法。此法可選波長個數l=(n+4)-(n+6)。l過小,提供信息量不足,l過大,對結果改進作用不大。本法對波長位置的選擇無需像AKC法那樣嚴格,結果精度也較AKC法高。本法的不足之處是有時個別組分的計算結果誤差稍大。

3.CPA矩陣法

最小二乘法要求進行二次求逆才能求解組分的未知濃度,故計算時的舍入誤差有時較大。CPA矩陣法是將吸收定律的數學表達式變形,用濃度作為吸光度函數的CPA矩陣(簡稱P矩陣)法,求解多組分濃度的方法。該法隻需一次求逆,波長個數l一般也小於最小二乘法,而測定結果多數情況會比最小二乘法好。

4.嶺回歸法

以上三種方法都采用了求逆計算,但當求逆時的係數矩陣接近退化時,其最小特征根(Ymin)接近零,會令用回歸法求得的組分濃度嚴重失真,因此均要求仔細選擇測定波長位置。嶺回歸法人為地引進了一個經計算求得的嶺參數K(K>0),使最小特征根變為Ymin+K,從而使嶺回歸估計值優於一般的回歸估計值。

嶺回歸法雖然也采用了求逆計算,但同上述三種方法相比,可以使用較多的波長個數,且對波長位置的選擇不太苛求,是對多元線性回歸法的改進。嶺回歸法是解決係數矩陣接近退化時的病態方程組問題極有效的方法之一。

5.偏最小二乘法(PLS法)

PLS法利用m個混合標準的濃度矩陣cm×n和l個波長點上的吸光度矩陣Am×l,按照一定的數學算法進行迭代計算,而求解組分濃度的多元統計分析法。

PLS法是一種能充分利用混合標準中的濃度和吸光度信息,不用求逆的數據處理方法。它有較強的抗隨機幹擾能力,對波長點位置的選擇不太苛求,是多組分同時測定的有效方法之一,也是解決係數矩陣接近退化時的病態方程組問題極有效的方法之一。

6.卡爾曼(Kalman)濾波法

Kalman濾波法是另一種不用求逆的求解多組分濃度的方法。濾波法就是從一係列含有幹擾的吸光度信號中,盡可能濾除幹擾,分離出所需的較為準確的濃度值遞推濾波的方法。因Kalman法是利用遞推計算,故方便與儀器聯機使用,但不足之處是抗隨機誤差能力不理想。

以上各種方法是以線性關係為基礎,而20世紀90年代被廣泛應用、能解決非線性擬合的人工神經網絡技術,同樣能有效求解多組分濃度。

除上述所介紹的測定方法外,在楊祖英教授主編的2001年版《食品分析》第五章中,較詳細地介紹了用於二組分或三組分混合液測定的雙波長等吸收點法、雙波長係數倍率法、三波長三點一線法、多波長線性回歸法、正交函數分光光度法及用於混合溶液或混濁液測定的導數分光光度法。詳細內容參考相關文獻。

計算分光光度法的應用將大大減少乃至無需進行物理的或化學的分離過程,通過所謂“數學分離”方法直接對各組分進行測定。計算分光光度法借助於計算機的幫助,使分析測定條件變得優化,操作變得簡單,提高了功效。但是,計算分光光度法並非很完善,方法本身還需提高,內容尚待進一步提煉和充實,當前,更重要的是如何開發出具有實用價值的“計算分光光度法多組分測量係統”儀器或軟件。

六、紫外-可見分光光度法的特點

(一)入射光接近於單色光

與比色法相比,比色法的入射光是一段譜帶較寬(比如50nm)的光譜帶,而分光光度法則不同,其入射光必須接近於單色光,光譜帶寬度最多不超過3~5nm,最窄的在1nm以下。所以,分光光度法所需的入射光不是用濾色片(光電比色法采用濾色片分單色光)分離出來的,而是用棱鏡或光柵分出不同波長的光。采用分光光度法的儀器稱為分光光度計,其結構較光電比色計複雜、精密。

(二)分析對象廣

紫外-可見分光光度法應用很廣泛,對於有色化合物(或與某種物質反應後能產生有色物質的化合物)和分子含有不飽和鍵的無色化合物均可進行有效分析。例如食品中維生素A、維生素D可在328nm、265nm波長下分別測定,食品中的添加劑苯甲酸可在225nm波長下測定,啤酒中的苦味成分異α-酸可在275nm波長下測定。

(三)靈敏度及準確度高

由於分光光度法的入射光是以棱鏡或光柵為分色器,同時又用窄縫分出的譜帶很窄的一束單色光,因此其測定的靈敏度、選擇性和準確度很高。紫外-可見分光光度法可測定微量物質,測定靈敏度可達10-7~10-4g/mL,定量測定的精密度一般為0.5%,而在校正過的儀器上測定精密度為0.2%。

(四)選擇性好,操作簡便

由於分光光度法使用的是單色光,而且隨著計算分光光度法的推廣,用它來測定含有兩種或兩種以上組分的試樣時,不必事先進行分離,而隻要選用不同種特定波長的單色光即可,分析操作容易掌握。此外,紫外-可見分光光度法還具有儀器設備簡單價廉的特點。

盡管紫外-可見分光光度法在定性方麵趕不上紅外光譜,在定量的準確度、精度及靈敏度等方麵趕不上液相、氣相、質譜、電子鼻或電子舌等高精度的儀器,但由於該法具有上述優點,考慮到儀器的性價比良好,因此在食品分析中,特別是定量分析中,紫外-可見分光光度法的應用還是相當廣泛的。

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