④pH 6.0磷酸鹽緩衝液：稱取2.0g磷酸氫二鉀和8.0g磷酸二氫鉀，加蒸餾水溶解，並稀釋至1L。
3．儀器
高效液相色譜儀，紫外檢測器，超聲波清洗儀。
4．測定方法
（1）四環素、土黴素的提取稱取切成1cm左右的肉樣10.0g於100mL比色管中，加入0.01mol/L EDTA二鈉+0.04mol/L H3PO4（1+1）混合液30mL搖勻，再加入50%三氯乙酸2mL。充分搖勻，用EDTA磷酸混合液稀釋定容至50mL，樣品液全部轉移至勻漿瓶中，組織勻漿機高速勻漿1min，勻漿液於45℃以下水浴保溫15min，待靜置分層後，離心10min（2500r/min），上清液用快速濾紙過濾，收集濾液25mL備用，用甲醇2mL浸潤Sep-Pak C18小柱（重複使用的柱子用甲醇，5%EDTA二鈉溶液交替衝洗，然後用甲醇浸泡），再用10mL蒸餾水置換，然後用5%EDTA二鈉水溶液5mL流過，最後用10mL蒸餾水衝洗，共洗4次。然後加10mL甲醇溶出，溶出液供高效液相色譜分析。
（2）氯黴素的提取稱取切成1cm左右的肉樣10.0g於100mL比色管中，加入磷酸鹽緩衝液（pH 6.0）30mL，搖勻，慢慢加入50%三氯乙酸溶液（邊加邊搖，避免局部過酸），用磷酸鹽緩衝液稀釋定容至50mL，樣品液全部轉移至勻漿瓶，組織勻漿機高速勻漿1min，室溫放置15min，用快速濾紙過濾，收集濾液，濾液經0.45μm濾膜再過濾，取其濾液進行高效液相色譜分析。
（3）高效液相色譜參考條件
①色譜柱：Nucleosil C18。
②流動相：0.01mol/L磷酸氫二鈉（pH 2.5含0.001mol/L EDTA二鈉）+乙腈（75+35）；0.05mo1/L磷酸二氫鈉（pH 2.5）+乙腈（65+35）。
③流速：0.5mL/min。
④波長：265nm。
⑤靈敏度：0.05AUFS（四環素、土黴素），0.1AUFS(氯黴素)。
（4）測定分別進樣品液和標準液於高效液相色譜儀，樣品峰麵積與標準峰麵積比較，外標法定量。
5．結果計算
x=(A1C/A2m)V
式中x——樣品中抗生素含量，mg/kg
A1——樣品峰麵積
A2——四環素、土黴素、氯黴素標準峰麵積
m——樣品質量，g
C——四環素、土黴素、氯黴素標準液濃度，mg/L
V——樣品溶液稀釋體積，L
6．其他
（1）分析波長的選擇土黴素在268nm、358nm處有最大吸收，四環素在268nm、358nm處有最大吸收，氯黴素在278nm處有最大吸收，本法選用265nm作為檢測波長。
（2）標準曲線和線性範圍分別精確量取四環素、土黴素標準溶液適量，使成5、10、20、30、40mgL標準係列濃度。精確量取氯黴素標準溶液適量，使成10、20、30、40、80、100mg/L標準係列濃度，分別進樣20μL，在此條件下，均成良好線性關係。
（3）流動相的選擇采用磷酸氫二納-EDTA-乙腈（加入0.001mol/L EDTA）分離效果更好。
（4）流動相pH對分離效果的影響分別配製pH 7.0、4.0、2.5的磷酸二氫鈉緩衝液，觀察不同pH的流動相對四環素、土黴素分離效果的影響，實驗證明pH 7.0和pH 4.0的情況下，土黴素與四環素的分離效果不好，色譜柱對抗生素有較強的吸附作用，因此選擇流動相的pH為2.5。
（5）提取方法的選擇因三氯乙酸沉澱蛋白質效果較好，離心後的上清液可通過一般濾紙過濾，Sep-PaK C18小柱富集後，甲醇溶出液可直接進行液相分析，操作比較簡便，利於開展大批量樣品的分析。但對氯黴素而言，采用Sep-Pak C18小柱富集提取回收率偏低，磷酸緩衝液法可提高氯黴素的回收率。
（四）果蔬及製品中展青黴素的測定
1．原理
展青黴素（Patulin，下稱Pat）是由青黴和某些曲黴所產生的有毒代謝物，對人體有較強的三致作用，主要存在於水果、蔬菜及其製品中，樣品中的Pat經有機溶劑萃取處理後，經高效液相分離，根據保留時間進行定性，峰高進行定量。
2．試劑
乙腈、無水硫酸鈉用分析純。
碳酸鈉溶液：稱取2.0g碳酸鈉（Na2CO3），溶於水中，並用水稀釋至100mL。
展青黴素標準儲備液：精確稱取展青黴素10.0mg，用甲醇溶解，並定容至10.0mL。此液每毫升含1mg展青黴素。
展青黴素標準使用液：將展青黴素標準儲備液用甲醇稀釋成含展青黴素0.5，1.0，1.5，2.0，2.5μg/mL的標準係列溶液。
3．儀器
高效液相色譜儀，紫外檢測器，CSF-3A超聲儀，800色譜工作站。
4．測定方法
（1）樣品處理取試樣5g於25mL具塞離心管中，加入10mL乙酸乙酯振搖2min，超聲萃取5min，1500r/min離心5min，用滴管吸取有機溶劑於125mL分液漏鬥中（再重複上述萃取2次，每次加入乙酸乙酯5mL），於分液漏鬥中加入1mL 2% Na2CO3溶液，振蕩2min，靜置分層後棄去Na2CO3層，再重複上述操作2次，有機相經盛有1g無水Na2SO4的漏鬥濾入K-D濃縮器中，N2氣流下50℃蒸幹，用甲醇定容至0.5mL，供HPLC用。
（2）高效液相色譜參考條件
①色譜柱：Zobax C18 4.6mm×250mm，5μm。
②柱溫：35℃。
③流動相：乙腈+水（5+95）。
④流速：1.0mL/min。
⑤檢測波長：275nm。
（3）校正曲線的繪製分別進樣展青黴素標準係列溶液10μL，以不同濃度展青黴素對峰高值製成校正曲線。
5．結果計算
x=m1×1000/(m2V2/V1)
式中x——樣品中展青黴素的含量，μg/kg
m1——進樣體積中展青黴素的質量，μg
V2——進樣體積，mL
V1——樣品稀釋總體積，mL
m2——樣品質量，g
（五）食品中煙曲黴震顫素B的測定
1．原理
樣品經處理後，直接進入高效液相色譜儀分析，以保留時間定性，峰麵積定量。
2．試劑
乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮用分析純；乙腈用色譜純。
3．儀器
高效液相色譜儀，紫外檢測器。
4．測定方法
（1）樣品處理稱取5g已粉碎的玉米，放入帶塞三角瓶中，加入50mL三氯甲烷，振蕩提取1h，直接取少量提取液通過0.45μm濾膜過濾，取濾液20～50μL進樣。
（2）高效液相色譜參考條件
①色譜柱：BIO-RAD BIO-SIL ODS-5S C18 4mm×250mm或BECKMAN spherisorb ODS C18 4.6mm×250mm。
②流動相：A液為10% MeOH～H2O；B液為90% MeOH～H2O。
流脫程序：0～1min，A100%從2.0mL/min梯度降到0.5mL/min；1～12min，A 0.5mL/min；12～14min，A 100% 0.5mL/min梯度轉至B 100% 1.0mL/min；維持6min後，在2min內流動相由B 100% 1.0mL/min梯度轉至A 100% 2.0mL/min，在此條件下再維持10min後進下一個樣品。
③檢測波長：225nm。
（3）測定點進樣品提取液20～50μL。並同時進入煙曲黴震顫素B（FTB）的標準溶液，與標準比較。以保留時間定性，峰麵積定量。
5．結果計算
x=cV/(m×1000)
式中x——樣品中煙曲黴震顫素B的含量，μg/kg
c——被測液中煙曲黴震顫素B的含量，μg/mL
V——樣品提取液的總體積，mL
m——樣品質量，g