來自東方的威脅今川家被打回了駿河，而三河的德川家也和織田家結了盟，信長終於能無後顧之憂地走出爭霸天下的第一步。他首先要對付的，就是北方美濃國的齋藤家。
1561年，織田信長驅逐了尾張管領斯波家。之前織田家還是在名義上受斯波家節製，從此以後，信長變成了真正的尾張之主。
齋藤義龍殺了父親齋藤道三，成為美濃的大名後，也沒停止過打尾張的主意。義龍不但勇猛善戰，而且詭計多端不亞其父。（看來還是道三親生）他先後策反了織田家的織田信廣和織田信清，把信長鬧了個手忙腳亂。可倒黴的是義龍不久就得了麻風病，1561年就死了，年僅35歲。義龍的兒子齋藤龍興繼位。
齋藤龍興是個紈絝子弟，既無祖父的智略，也無父親的武勇，還寵幸奸佞，遠離重臣。一時間群臣離心離德。這一切都被近在尾張的信長看在眼裏。自從收到齋藤道三送給自己的遺詔以後，信長也是念念不忘美濃這筆嫁妝。傳說信長經常半夜起來眺望北方，長噓短歎。一夜，妻子歸蝶問道：“殿下在這裏看什麼？”信長狼狽的回答道：“啊！星辰、北鬥……”“您是在眺望稻葉山的白色城樓罷！”夫妻兩人會意的相視而笑。（其實就像是衣帶詔，天知道那遺詔是真是假。無非是給信長明火執仗的強盜行徑找法理依據罷了。）
就在齋藤義龍死後兩天，信長便出兵美濃攻擊齋藤家。（“道義”兩字看來從未寫在信長的字典裏）兩軍在美濃大戰10餘日，不分勝負。信長的弟弟織田朝方還戰死於此役。
1563年，信長把自己的居城北移到小牧山城，對齋藤家居城稻葉山城虎視耽耽。但齋藤龍興根本不為所動，自以為稻葉山城牆高河深，牢不可破。眾家臣苦勸不聽。其中有一個叫竹中半兵衛（竹中重治）的，決定兵諫。一天夜裏，竹中重治帶領16名士兵，用計奪下了號稱難攻不落的稻葉山城，齋藤龍興倉惶出逃。竹中見警告得差不多了，半個月後又把稻葉山城還給了龍興，自己卻隱居了起來。竹中重治因為此役名動天下，被稱為戰國第一軍師。（有這樣的能臣而不用，齋藤家不滅亡還真沒天理了）不久信長部將木下秀吉用三顧之禮請竹中重治再次出山。（仿佛劉備諸葛亮故事，又有抄襲之嫌....）
用農村包圍城市的方法，信長先後攻占了稻葉山城周圍的鵜沼，猿啄，金山等城，孤立了稻葉山城。1566年，在足利義昭的斡旋下，織田家和齋藤家暫時講和，但沒維持兩個月。9月，織田家部將木下秀吉在稻葉山城的咽喉之地墨俁連夜造了一座堡壘，徹底封鎖了稻葉山城。1567年，齋藤家的重臣，俗稱“美濃三人眾”的稻葉一鐵、氏家卜全、安藤守就投降了信長。這對齋藤陣營是致命的打擊。不久，信長就直接兵圍稻葉山城。龍興眼見反擊無望，隻得棄城逃跑。齋藤家滅亡。
距離齋藤道三死後11年，信長終於得到了夢寐以求的“嫁妝”：稻葉山城和整個美濃國。意氣風發的信長將稻葉山城改名歧阜城。“歧”字取自周朝的發跡之地西歧山，而周的開國之君是周武王。由此可見信長的誌向，就是要以“武功”統一天下啊。（一個日本軍閥竟然知道這麼多中國的典故？...）信長更把“天下布武”四個字刻在印章上，以示奪取天下的野心！