《牡丹亭》寫的是太守女兒杜麗娘與書生柳夢梅生死離合的愛情故事。南宋初年，江西南安太守杜寶的女兒杜麗娘，年過二八，美麗靈秀，父母對她管教甚嚴，用封建禮法束縛她，力求把女兒培養成德、容、工、貌的大家閨秀，還請來一個年近六十的老儒生陳最良來教女兒。但麗娘正值青春妙齡，有強烈的追求自身幸福的意識。一日，她趁父母不注意，帶丫環春香偷遊後花園，被美麗的春光陶醉，後夢中與一書生相會，和書生在花園牡丹亭相親相愛，醒來後仍思慕書生，竟相思成疾，香消玉殞。麗娘生前曾自畫一幅真容小像，臨終前讓春香把小像藏於太湖石底，又讓父母把自己葬在花園的一棵梅樹下。麗娘剛歿，杜寶接到聖旨，要到淮揚抵禦金兵。他按麗娘的遺囑把她安葬好，然後舉家遷往淮揚。三年後，嶺南公子柳夢梅赴京應試，路過江西南安時，偶得麗娘小像，遂對畫中女子產生愛慕之情。而麗娘死後鬼魂在陰間遊蕩，判官憐其深情，放她到陽間尋找意中人。後來麗娘魂魄在自家梅花觀中遇到柳夢梅，發現他就是三年前夢中的那個書生，遂與他相好。兩人恩愛數日，麗娘將真情告訴柳夢梅，柳則掘開她的棺墓，助麗娘返回陽世。麗娘複活後，兩人結為夫妻，後來柳夢梅帶麗娘入京赴試，又到淮揚探視嶽母的下落，但杜寶見到柳夢梅後，並不相信他是自己的女婿，隻當他是盜墓賊，將柳夢梅鞭笞毒打，關進大牢。待真正見到複生的女兒後，杜寶也不相認，說麗娘是花妖樹精，後來柳夢梅中了狀元，上書朝廷為自己辯解，麗娘也登朝申訴，在皇帝的調解下，一家人才歡喜團圓。
《牡丹亭》是一部浪漫主義愛情劇，女主人公杜麗娘是個具有叛逆性格的少女，身為官家小姐，接受封建倫理教育，但她不甘於被困在閨房裏，她骨子裏有掙脫束縛的因子，遊園夢到柳夢梅與自己相會後，她頓時傾心相愛，不管現實中有沒有這個人，她都要執著尋夢，這份癡情是她作為青年女子的本性流露。麗娘因夢慕情，為情而死，然而死卻不是終結，而成為她再生的起點，死後及死而複生的麗娘已完全拋開封建道德的束縛，大膽自由地與柳夢梅相愛，並結為夫妻。杜麗娘慕情而死，又為情而生，世間癡情者莫過於她，這是人的至真本性的自然流露。凡事莫過於一死，而愛情突破生死的界限，則一切倫理綱常、道德理法都無法約束它。
柳夢梅是個有才學的書生，也具有風流書生的通性，同樣希望與一位才貌雙全的女子結一段情緣。在故事中，他好像是專門為杜麗娘而生的，麗娘懷春、得夢、病死，他則入夢、得畫、救生，麗娘的生死係於他一人，而他的生命則因麗娘的出現而精彩，兩人生死相戀的情緣突破一般才子佳人的故事，既浪漫傳奇，又不失本真。
而杜寶是個嚴厲的父親，是個恪守封建道德觀念的官僚，他嚴格管束女兒，禁錮年輕人的心靈。而另一方麵作為官員，他又勤政愛民，公而忘私，他是完全符合封建道德思想體係的人。麗娘的生死悲劇都是他一手造成的，他完全按照自己的想法去管教女兒，甚至女兒死而複生，也不能動搖他的本位思想。他是無情的，既被自己的思想控製，又拿自己的思想控製別人，杜寶是當時的社會製度調教出來的標準人物。
《牡丹亭》用浪漫的創作手法，極力渲染誇張了青年男女熱烈追求幸福愛情的力量，歌頌了真摯的愛情，強調個性解放，具有強烈的時代意義和戰鬥精神。湯顯祖寫成《牡丹亭》的時間與英國莎士比亞的《羅密歐與朱麗葉》問世極為相近，二者被稱為東西方戲劇史上的“雙璧”，兩人各自寫出了帶有本國社會氛圍和藝術特色的不朽悲劇，這是一種偶然，又是一種曆史的必然。男女主人公對美好愛情和自由婚姻的追求，不僅是簡單的個人欲望，而且是他們所處的曆史潮流下的必然要求。
但《牡丹亭》最終以封建皇帝破解所有矛盾，全家團圓，得到封號，這又說明湯顯祖的思想複雜性：既反封建束縛，又囿於封建思想的控製。這樣的結尾使全劇的氣氛及整體訴求打了折扣。故事中的杜麗娘能起死回生，並繼續完成她的愛情，而現實中又有多少男女為愛情而死，卻不能死後複生？湯顯祖的浪漫幻想，讓無數活著的人潸然淚下。