西班牙王查理一世繼承祖母天主教徒伊莎貝爾的傳統，廣為搜羅佛蘭德斯及意大利繪畫作品。當時正值意大利文藝複興，意大利著名畫家提香引得查理一世的讚賞，曾受命為他畫肖像。其子腓力二世偏愛神話與宗教題材。現存普拉多的幾幅蒂齊亞諾的維納斯，全由他羅致。但他卻不欣賞埃爾·格雷科的天才。
腓力三世及其子腓力四世則都推崇魯本斯及其他17世紀佛蘭德斯畫家。為此，普拉多今藏魯本斯作品達80件之多，凡·代克26件、約爾丹斯10件、滕尼爾斯51件，以及佛蘭德斯畫派的肖像、宗教、神話、風景、靜物、風俗等各類作品，加上早先皇室收集的韋伊登、坎平、鮑茨、達維德、梅齊斯、帕蒂尼爾、博斯赫、布呂格爾父子等名家手跡，從而成為世界上收藏佛蘭德斯畫派作品最豐富、最重要的博物館。
哈布斯堡王朝最後一位國王查理二世注重意大利巴羅克大師盧卡·焦爾達諾的藝術，收其作品竟達百幅之數。在兩個世紀中的皇家西班牙藝術收藏更是蔚為可觀。許多藝術家曾為宮廷服務，或畫像，或記事。其中，貝拉斯克斯便是突出一例。
在意大利繪畫收藏方麵，早在查理一世時即搜羅了安傑利科、曼泰尼亞、拉斐爾、科雷喬、薩爾托等人作品，後來各處皇家宮室又大量收入蒂齊亞諾，現在普拉多就有其作品近四十幅。此外還有焦爾焦內、洛托、皮翁博、韋羅內塞、丁托列多、帕爾馬、巴薩諾父子等巴羅克巨匠之作，以及卡拉瓦喬、雷尼、卡拉奇兄弟、阿爾巴尼、多梅尼基諾、科爾托納等許多藝術家的佳作。
1700年，波旁家族繼哈布斯堡王朝登上西班牙王位。法國路易十四之孫菲利普五世在成為西班牙國王之後，帶來為數眾多的法國17、18世紀作品。除古典大師克洛德·洛蘭和尼古拉·普桑之外，還有裏戈、拉爾吉利埃爾、朗克、旺·洛等肖像大家，以瓦托為代表的行樂圖派，以及其他風景、神話、裝飾等各類畫家的作品，不斷湧來。
18世紀，還有不少意大利及法國畫家到西班牙宮廷為菲利普五世、斐迪南六世和查理三世服務。於是，在皇室收藏中，蒂耶波洛父子、阿米戈尼、賈昆托、索利梅、巴托尼等人之作大增，甚至德國畫家門格斯也以畫筆為查理三世效勞，畫了許多肖像、宗教畫和壁畫。
查理四世統製下的西班牙雖因法國入侵而備嚐艱辛，但仍有相當數量的藝術品為皇家購入。反抗拿破侖的持久而殘酷的獨立戰爭於1813—1814年結束，斐迪南七世繼位，他成為普拉多的締造者。
在普拉多收藏中，最主要的部分畢竟是西班牙畫派浩瀚的、具有世界意義的作品。中世紀直至20世紀末的整個西班牙藝術發展史，可從普拉多的收藏中得到完美的反映。這一無與倫比的珍藏，體現了西班牙繪畫在思考、創作、感受、觀察、繪製等各個方麵的獨特方式。
在前幾個世紀中尚湮沒無聞的中世紀繪畫，於20世紀進入了普拉多。從貝爾蘭加的聖包德洛教堂和馬德魯埃洛的聖十字隱修院等處移來的精美羅曼壁畫，到許多傑出哥特祭壇畫，反映了12至15世紀之聞伊比利亞半島上獨特的文化。眾多佚名或知名的大師代表著羅曼式、線式哥特式或法蘭西哥特式、14世紀潮流、國際哥特式或西班牙—佛蘭德斯風格——這是來自低地國家的表現程式與西班牙畫派傳統精神的融合。從費爾南多·加列戈至佩德羅·貝魯格特這一階段，標誌著早期文藝複興的到來。
達·芬奇的藝術在亞涅斯·德·拉·阿爾梅迪亞的作品中得到反響。至於16世紀意大利的光輝，則反映在胡安·德·華內斯以及巴倫西亞派和托萊多派的創作中。這兩派已轉向樣式主義；稍後的路易斯·德·莫拉萊斯和埃爾·格雷科卓然不群的肖像及宗教作品，尤其揭示了這一發展。普拉多擁有34幅精彩的埃爾·格雷科作品。與此同時，腓力二世的一些畫師如桑切斯·科埃略、潘托哈·德·拉·克魯斯等人，也都是觀察敏銳、風格莊重的肖像高手。
西班牙的巴羅克藝術，由塞維利亞派、巴倫西亞派和馬德裏派的畫家宣告。普拉多收藏他們作品的數量極為驚人：貝拉斯克斯50幅、蘇爾瓦蘭22幅、裏瓦爾塔6幅、裏韋拉50幅、卡諾10幅、穆裏略40幅、巴爾德斯·萊亞爾6幅、卡雷尼奧·德·米蘭達10幅、克勞迪奧·科埃略10幅，以及其他諸如帕切科、兩位埃雷拉斯、安托利內斯、塞雷索、埃斯卡蘭特、佩雷達、阿雷利亞諾、範·德爾·阿曼、桑切斯·科坦、卡杜喬、卡赫斯、卡斯特洛、馬索、阿圭羅、裏奇等藝術家的肖像畫、曆史畫、宗教畫、靜物畫、風景畫和各類裝飾作品，數不勝數。這些畫家為西班牙藝術動人心魄的“黃金世紀”做出了重大貢獻。