（二）大鼠的剖腹產
1.術前準備
（1）器材與消毒參照小鼠剖腹產術。
（2）孕鼠的選擇選擇健康動物，檢查陰道栓的產生，確定配種日期。發現有預產征兆應立即進行手術。手術在產前2h進行較易獲得成功，過早影響人工哺乳成活率，過遲則喪失機會或造成感染。
2.手術過程CO2麻醉動物，麻醉時，取幹冰適量放入燒杯中，加少量水，使之產生二氧化碳，將燒杯罩在大鼠頭上，使其仰位固定在手術台上。用5%碘伏將胸腹部浸濕消毒，蓋上手術巾，沿腹中線切開皮膚。用止血鉗把切開的皮膚與手術巾鉗合，分離皮膚與肌肉，用碘伏消毒胸骨柄至後腹部，沿胸劍骨處至後腹部切開腹肌暴露子宮，切勿劃破腸管，用止血鉗夾住子宮頸與兩側輸卵管，並切斷。將子宮放入傳遞袋中，經滅菌渡槽移入隔離器內。用大量無菌水衝洗子宮，用2把鑷子將子宮撕破取出胎仔，另一人擦去口、鼻部羊水，促其呼吸，擦幹胎仔身體。當胎仔體色由紫轉紅潤後放入鼠盒保溫，清除隔離器中的廢棄物，將胎仔編號。
（三）犬的剖腹產
1.術前準備
（1）手術隔離器的準備犬的體形較大，隔離器各種用品及消毒滅菌同前，與隔離器相連接的藥液渡槽及傳遞倉口徑相應要增大，以便仔犬順利通過。
（2）孕犬的選擇在健康犬群中選取經產雌犬，於發情開始後2～4日配種，記載配種日期。確定懷孕後，於配種後60天左右準備手術。分娩前母犬外陰和乳房腫脹，食欲下降或不食，是手術的時機。
2.手術方法
（1）麻醉按20mg/kg劑量注射氯胺酮，10min左右，進入麻醉期。
（2）固定與消毒將犬仰臥固定，於腹部手術區域剪毛，用3%碘伏消毒，以75%乙醇脫碘。將滅菌巾固定在皮膚上。
（3）剖腹取胎沿腹白線，從臍後至恥骨前3cm切開皮膚，打開腹腔，移出兩子宮角。在子宮角中部做一切口，以滅菌塑料袋口對準切口，將胎盤包裹的仔犬引入袋中，用止血鉗夾住袋口，每袋一犬，將袋浸入藥液渡槽傳入隔離器內，迅速打開塑料袋，切開胎盤，取出仔犬，留2cm臍帶切斷，擦淨口、鼻、體表黏液，放入保溫盒中。采用子宮切除術在無菌方麵更保險，但要損失種犬。
（4）術後護理母犬按常規縫合切口，做外科處理，精心護理，康複後可繼續繁殖。
第三節 生殖細胞的培養
細胞培養技術（cell culture）是從動物體內取出細胞，模擬體內的生理環境，在無菌、適溫、豐富的營養條件下，使離體細胞生存、生長並維持結構和功能的一門技術。細胞培養技術是離體方法中主要的一種。
一、睾丸間質細胞、支持細胞和生精細胞的分離與培養
（一）材料準備
1.儀器設備超淨工作台、CO2培養箱、離心機、低溫冰箱、恒溫水浴、普通及倒置顯微鏡及一般實驗室設備如網篩、濾器等。
2.器械與器皿手術剪、手術刀、培養皿、注射器。
（二）操作步驟
1.睾丸間質細胞的分離和培養選取16～18日齡的雄性SD大鼠，無菌條件下取出睾丸，用培養液洗3次，剝去白膜，剪碎（至1mm3），用0.5%膠原酶和0.1%透明質酸酶，36℃振蕩消化15min，靜置4min；吸取上清液，過400目不鏽鋼篩網，濾液1000r/min離心5min。去上清液，用培養液洗滌3次，以除去殘留的酶。離去洗滌液後，加入一定量的培養液，製成間質細胞懸液。計數，按每孔（1～2）×105個細胞接種於24孔培養板中。置於37℃，5%CO2培養箱中培養。24h貼壁後，更換培養液，除去懸浮的細胞碎片，繼續培養（注意設空白對照和溶劑對照）。以細胞的存活率、細胞的形態變化和細胞在hCG刺激下，內源性地合成、分泌的睾酮到培養液的含量為指標，觀察和分析測試藥物對間質細胞的直接作用。
2.支持細胞的分離和培養在（1）去除間質細胞後的曲細精管小段，經0.3ml、0.5%膠原酶，35℃消化20min。待小管稍下沉後，棄去上清液。再經0.08%膠原酶在35℃水浴，振蕩，消化4min，通過200目不鏽鋼篩，濾液靜置4min，去除懸浮在上清液的血細胞、間質細胞和精原細胞。此後操作同（1）。細胞培養24h後，支持細胞均已貼壁展開，顯微鏡下觀察幾乎無其他細胞混雜，更換培養液，除去懸浮的細胞碎片。並加入受試藥物繼續培養。以細胞存活率、細胞形態變化及細胞在FSH刺激下將雄烯二酮轉化為雌激素的能力為指標，觀察測試化合物對支持細胞的直接作用。
3.生精細胞的分離和培養選用90日齡的SD雄性大鼠，無菌條件下，摘取一對睾丸，剔除包膜，切成碎塊（1mm3），和膠原酶（1mg/ml）、DNA酶（20μg/ml）一起孵育45min，34℃，以去除間質細胞和類肌樣細胞。餘留的曲細精管碎塊用膠原酶（0.1mg/ml）進一步消化10min，然後通過濾膜，濾去細胞殘片，製得生精上皮單細胞懸液。用DMEM洗2次，重新混懸在含有0.5%BSA、1mmol/L EDTA、0.5%mmol/L葡聚糖鈉和5mmol/L 乳酸鈉的Han’s F12/DMEM中，收集經過淘析器得到較純的生精上皮細胞，並用F12/DMEM 洗2次，然後重新混懸在含有10——7mmol/L的睾酮、10mmol/L乳酸鈉、0.7%mmol/L 丙酮酸鈉和2mmol/L L-膚胺的F12/DMEM中。在光鏡下計數細胞，觀察純度，並稀釋至1×106細胞/ml。培養在含20～30ml的生精細胞培養液的100nm培養皿中；每天更換一次培養液，培養24h後，生精上皮細胞已貼壁展開，鏡下觀察幾無其他雜細胞。加入含待測化合物的新鮮培養液，處理72h後，終止實驗。以細胞存活率或細胞形態改變為指標，觀察待測化合物的直接作用。
二、黃體細胞的分離和培養
1.材料準備同上。
2.操作步驟取22～25日齡的幼年雌性SD大鼠，皮下注射孕馬血清促性腺素（PMSG）30IU/隻，65h後皮下注射人絨毛膜促性腺素（hCG）50IU/隻。HCG處理後第5天，在無菌條件下取出雙側卵巢（此時的卵巢幾乎全部由黃體組織構成）。用培養液洗滌3次後，剝去外層白膜，用4號針頭刺破黃體，再將之剪碎。用0.1%BAS-HEPES培養液稀釋膠原酶，使其最終濃度為200IU/ml，以組織量的3倍加入消化液，在36℃恒溫水浴振蕩消化（每隔5min用吸管吹打1次），20min後吸出上清液過150目不鏽鋼濾網。加入一定量含5%新生小牛血清的McCoy’s 5A培養液成細胞懸液，計數細胞，按（1～2）×105個細胞/孔的濃度種於塗有鼠尾膠的24孔培養板中，培養板置於37℃，5%CO2培養箱，24h後，更換不含血清的McCoy’s 5A培養液，加入受試物，繼續培養。
三、卵泡細胞的培養
1.材料準備同上。
2.操作步驟取22日齡的雌性大鼠，於晨8時皮下注射DES油溶液，每次0.5mg，每天1次，連續3天，第4天晨9時處死大鼠；在無菌條件下，迅速取下卵巢，去除周圍組織及卵巢表麵包膜，用冰冷McCoy’s 5A培養液洗滌3次。解剖鏡下，用4號不鏽鋼針刺破卵巢表麵的成熟卵泡（每隻卵巢可有10～15個發育成熟的卵泡），使顆粒細胞釋放於培養液中。棄去卵泡膜後，將顆粒細胞轉移至10ml無菌的刻度離心管中，4℃、1000r/min 離心7min，棄上清液；向沉澱在管底的疏鬆細胞團塊加入新鮮的MCsy’s 5A培養液，吹打均勻，並稀釋到2×105/ml顆粒細胞懸液混勻，分裝於Falcon多孔培養皿，每一培養皿含1ml顆粒細胞懸浮液。然後，置於37℃，5%CO2培養24h。更換培養液，加入含受試物McCoy’s 5A培養液，繼續培養。
第四節 大鼠離體子宮實驗方法
子宮的活動及對藥物的敏感性隨著動情周期而變化，對動情周期較短的動物，如小白鼠或大白鼠，可根據陰道細胞學檢查，挑選動情期的動物進行實驗。也可以在實驗前1～2天，每天給動物皮下注射己烯雌酚0.1mg/kg體重，人工造成動情期，以提高子宮的敏感性。
一、實驗器材
平滑肌離體灌流恒溫裝置、常用手術器械、自動控溫儀、記紋鼓或記錄儀、通用杠杆或張力換能器、溫度計、顯微鏡、鐵支架、載玻片、蓋玻片、氧、棉線、縫針、培養皿、腎上腺素（1：10000）、催產素（0.1單位/ml）、低Ca2+洛氏液、己烯雌酚。
二、操作步驟
1.取體重280～350g左右，成年未孕雌性大白鼠，經陰道塗片鏡檢確定其處於動情期後，用頸椎脫臼法處死，背位固定於臘盆上，剖開腹腔，用鑷子輕輕撥開附在腸係膜上的脂肪，可見一對粉紅色的卵巢和與它相連的子宮角，末端是陰道。迅速從卵巢與子宮角間剪斷，下端在陰道處剪斷，取出兩側子宮。立即把子宮放入盛有低Ca2+洛氏液並通O2的培養皿中，輕輕剝離子宮壁上的結締組織和脂肪組織。從陰道處縱向剪開，將一側子宮角的下端（連陰道端）穿入一“S”形不鏽鋼小鉤，然後把小鉤固定在營養管底的彎鉤上。子宮角的另一端（連卵巢端）用縫針穿線結紮，把結紮線與描記部分相連。營養液的溫度保持在30～32℃，並不斷通入O2.
2.為保證子宮比較穩定地活動，必須對子宮加一定負荷，一般以1g為宜。加負荷的方法是在杠杆未與子宮連接前，先確定放大倍數（短臂與長臂的比例，即為放大倍數，如短臂為1，長臂為5，即放大5倍）。然後在短臂末端加適當負荷，使長短臂兩側重量處於平衡狀態，這時在長臂側與子宮連接點離支點等距離處加上的重量（如1g）即為子宮的負荷。
3.固定標本以後，應在營養液中穩定20min才進行實驗。先描記子宮平滑肌的正常活動曲線，然後向營養液中加入0.02ml催產素，可見子宮活動加強，待效應明顯之後，描記2～5min，便更換新鮮營養液衝洗2～3次。等標本恢複活動後，間隔20min再進行下一次實驗。如加入腎上腺素（1：10000）0.04ml，同樣觀察和記錄子宮活動的變化。
4.子宮平滑肌正常活動和加入各種藥物後，觀察的指標為強度（幅度）與頻率。幅度即以每次收縮所達到的最高點表示。頻率以每10min收縮的次數表示。子宮活動力，以強度和頻率的乘積表示。
三、注意事項
1.操作過程中應避免過度用力牽拉子宮組織，而且操作時間盡量短些，並注意供給O2.
2.低Ca2+洛氏液能消除子宮平滑肌的自發運動。可把洛氏液配方中的CaCl2由0.24g/L 改為0.06g/L。
3.每次加入藥物後的觀察時間，更換新鮮營養液的次數及2次加入藥物的間隔時間均應盡可能保持一致。
4.由於子宮平滑肌的活動十分緩慢，其收縮頻率約0.75次/min，若通過張力換能器和記錄儀記錄時，由於記錄儀的走紙速度快，往往描記不到理想的曲線。若用電動連續記紋鼓記錄，利用其走紙速度慢（0.08～0.15mm/s）的優點，可以長時間描記實驗結果，比較方便。