5.靜脈接種不同動物的靜脈注射部位不同。大、小鼠多選擇尾靜脈,兔耳外緣靜脈,豚鼠耳靜脈或後肢小隱靜脈,犬後肢小隱靜脈或前肢內側皮下靜脈。
6.腦內接種指將接種物注射到腦內。大、小鼠的腦內接種選擇兩眼窩後緣連線稍偏中線的部位,針頭刺破皮膚,垂直於額部刺入2~3mm,感到阻力減輕時,緩慢注入0.02~0.03ml。兔、犬、豚鼠等腦內接種時,將額部皮膚向一側拉緊,用手術刀劃一小口,用穿顱鋼針通過切口在頭蓋上開一小孔,通過小孔將注射器插入顱內緩慢注射,每次注射量0.1~0.2ml。
7.經口接種指將接種物注射到口內。通常將動物頭部抬高,後軀降低,固定好動物,經動物口角,將注射器插入口中,往動物舌後部送,推動注射器,讓動物自動吞咽。注射完畢後,用手觸摸動物咽部,促其吞咽。
(二)收獲方法
動物接種後,經過一定時間後,會產生病症或死亡,對這些死亡或殺死的動物進行剖檢,采集病變明顯的病料或肝、脾、腎、心髒、肺、腦組織、淋巴結、血液、腹水、腦積液等,置於密閉容器內,除立即使用外,放入低溫冰箱保存。
1.動物的屍體剖檢將手術器械高壓消毒,試管、培養皿及其他器皿高壓滅菌。大小鼠的屍體用大頭針固定於固定板上,兔、豚鼠等用繩子將其四肢綁在解剖板的釘子或環上。屍體放入較大的盤子中,用消毒藥水浸濕動物皮毛,用手術刀在胸部皮膚做一切口,用剪刀向前剪至頸部,向後剪至恥骨部,沿此線向四肢方向剪開,剝離皮膚。采集腦組織時將動物背部朝上固定,最後,依次剖開腹腔、胸腔及腦室。
2.病料的采集用無菌剪刀、手術刀、鑷子等,分離肝、脾、腎、心、肺、腦組織、淋巴結等器官。用無菌的吸管吸取腹水、胸水、心包液、腦積液、血液、尿液等體液,分離胃、小腸、大腸,將腸內容物擠出,采集腸及腸內容物,分別保存。
(三)屍體及廢棄物的處理
動物屍體及廢棄物用包裝袋密封好送焚屍爐燒毀。所用器械經高壓蒸氣滅菌,解剖板、盤子等用消毒藥水浸泡,操作人員手用消毒藥水浸泡後再用清潔劑洗淨,工作服經消毒藥水浸泡或高壓滅菌後清洗。
二、動物感染細菌和真菌的實驗方法
(一)動物感染細菌的實驗方法
細菌是引起人類傳染性疾病或人畜共患病的重要病原體之一。通過動物接種細菌,人類可以更好地研究和了解病原菌的致病機製、疾病的發生、發展過程,從而開展有效的預防和治療。
1.動物感染細菌的方法
(1)皮內接種通常以背部皮膚進行接種較為合適。接種量一般為0.1ml。此種方法主要用於皮膚感染的研究。
(2)皮下接種接種部位宜選擇皮膚比較疏鬆的部位,如腹部、腹股溝,但由於操作不便,實際操作中仍以背部接種為多,接種量0.1~1.0ml。此種方法適合於皮下感染的研究。
(3)肌內接種一般以動物的後腿根部較適宜,但家禽多選用胸部。接種量0.2~1.0ml。此種方法常用於某些毒素的毒性和生物學作用的檢驗,或檢測抗毒素的中和作用。
(4)靜脈接種常選用兔、小鼠、大鼠和豚鼠,兔一般選用耳緣靜脈,大、小鼠選用尾靜脈,豚鼠選擇後腿靜脈。此種方法主要用於血源性感染或敗血症的研究。
(5)腹腔接種多選用小鼠,接種量0.2~2ml,此種方法常用於腹腔感染動物模型的複製或細菌檢驗時需要恢複細菌的特殊結構、形態或細菌毒力的鑒定和恢複。
(6)顱內接種對小動物(如小鼠)可在動物顳部穿刺,刺入為0.3cm左右,注射量0.01~0.03ml,對較大動物(如兔)需用骨鉗將局部打開後接種,刺入深度為0.6cm左右,注射量為0.05ml。主要用於顱內感染的研究。
(7)足墊接種將吸有接種物的注射器針頭刺入足墊皮下,接種量一般0.1ml。此種方法主要用於麻風杆菌的接種感染。
(8)呼吸道接種主要有鼻前庭吸入接種和氣管穿刺接種2種:①鼻前庭吸入接種,將動物用乙醚淺麻醉,用卡介苗注射器吸取接種物,接上4.5號頭皮針,去除針頭,排除空氣,將頭皮軟管插入動物的鼻前庭,在動物吸氣時注入0.1~0.5ml左右的接種物,可反複多次接種;②氣管穿刺接種,將動物用0.3%的戊巴比妥鈉麻醉、固定後,剪開頸前皮膚,肌肉層做鈍性分離,暴露器官,用吸有接種物的卡介苗注射器(4號針頭)向氣管注入0.1~0.5ml接種物。此方法一般不能反複接種,主要用於急性感染性肺炎的研究。
(9)泌尿係統接種因動物泌尿道細小,接種困難,此種方法少用。較大的動物,如兔等可進行膀胱穿刺接種,接種量1ml左右。
(10)陰道接種動物以往主要采用猴和兔,近年來主要采用大鼠。需特製的導管,導管有適宜的剛性和彈性,頂端圓潤,尾部可與注射器乳頭結合。吸取接種物,排出氣體,將導管輕柔地沿動物脊柱方向插入大鼠的陰道內,插入深度一般為5~8cm,回抽注射器如有黃色液體,表明插入膀胱,如僅有少量分泌物或無分泌物抽出,表明插入陰道,注入接種物,一般0.5ml左右。
(11)消化道接種常采用灌胃法,一般小鼠插入深度3cm,大鼠、豚鼠或幼貓5cm,兔15cm,犬20cm。灌胃量視細菌種類和接種的目的而定。主要用於某些細菌製劑的研究。
2.動物感染成功的標誌主要包括兩方麵:①動物的非特異症狀,如動物感染後出現的食欲減退、精神萎靡、體重減輕,皮毛失去光澤、血常規改變、體溫上升,局部出現紅腫,膿性分泌物等炎症現象,局部分泌物的顏色、pH值改變等;②特異性標誌,在局部炎症分泌物或發熱期(菌血症)血液中分離到接種菌。
3.接種動物的解剖和病理學檢查動物死亡後應及時解剖並做微生物檢驗。如不能及時解剖,應將動物包好,置於低溫冰箱保存。否則,動物易腐爛,腸道中的細菌易穿過腸壁進入血液和其他髒器,給微生物檢驗造成困難。
解剖前應先注意觀察動物外表的情況改變,如接種部位的膿性分泌物的情況、體重的變化、體形的改變等。解剖時必須采用專用的解剖台、敷料和手術器械,在解剖某些傳染力較強或抵抗力很強的病原體感染而死亡的動物時,必須在專用的實驗室進行,以便手術後的消毒處理。
操作者穿隔離衣,戴手套、口罩和手術帽,然後取一搪瓷盤,底部鋪一層用消毒液浸泡過的紗布,將動物固定在一覆蓋有油紙或塑料薄膜的解剖台上進行解剖。剖檢過程簡要如下:局部準備解剖皮膚層打開腹腔打開胸腔打開顱腔。
4.解剖後的處理對所用器械、操作環境和工作服進行消毒滅菌處理,死亡的動物、籠盒、墊料做高壓滅菌處理,動物飼養環境也應進行消毒滅菌。消毒必須完全,以防止實驗室工作人員的感染和細菌造成疾病的發生、流行。
(二)動物感染真菌的實驗方法
動物感染真菌的實驗主要用於雙相型真菌的鑒定、恢複並加強保存菌種的活力和毒力、抗真菌藥物的前期研究等。
1.動物的選擇多數深部真菌和少數皮膚癬菌可用於接種動物,進行感染研究。由於不同動物對不同的病原菌易感性不同,根據菌種的特點選擇適當的動物非常重要。
2.動物的處理對正常動物進行真菌感染之前,通常需要對動物進行預處理,常見的方法有:注射免疫抑製劑、切除器官(唾液腺、卵巢)、膀胱輸尿管回流(稀醋酸液經尿道)、喂低蛋白食糧及麻醉等。免疫抑製劑常用環磷酰胺、醋酸可的鬆、糖皮質類固醇、環孢菌素A等。還可采用放射線照射處理。
3.標本的接種接種的標本有臨時標本,如磨碎的病理組織、膿液、尿液等,但常用的是已培養分離的純菌種。菌種應用生理鹽水製成混懸液,加入等量的5%豬胃黏素增強菌種的感染力。
(1)酵母和酵母樣菌的接種酵母和酵母樣菌主要指新生隱球菌和白色念珠菌。先製成生理鹽水混懸液,濃度一般為106/ml。接種5~10隻小鼠。每隻接種量:靜脈注射0.2ml,腹腔接種0.5~1.0ml。以後每隔2~3天處死1隻小鼠。取腎、肝、脾、腦或肺做組織病理切片、真菌直接檢查和培養,以檢查和分離病原菌,觀察病理反應。
(2)雙相型真菌的接種
1)球孢子菌接種於豚鼠睾丸,接種5隻。接種量為0.2~0.3ml,或以0.5~1.0ml做小鼠腹腔注射。以後每周處死1隻動物。檢查內髒和肺,觀察有無球囊和內孢子。
2)芽生菌一般不用動物接種檢查法,因動物對皮炎芽生菌多不敏感。若使用動物,可采用0.5~1.0ml注射於小鼠腹腔內,每周處死1隻。檢查腹腔、肝、脾或橫膈上有無膿腫,進行塗片檢查和培養。
3)孢子絲菌接種於豚鼠睾丸和腹腔內,小鼠和地鼠則腹腔接種,也可接種於鼠足墊內。睾丸接種後5~10天接種處有紅腫,足墊則在~8天內出現紅腫,腹腔接種後3~4天內有腹膜炎出現。
(3)放線菌的接種
1)以色列放線菌接種於硫乙醇鈉肉湯中厭菌培養7天。2000r/min下離心15min。取沉澱物與新鮮肉湯按2%濃度配製,於振蕩器上混合均勻。取小鼠5隻,每隻右側腹腔注射0.8ml 5%胃黏素,左麵腹腔內注射0.2ml接種液。以後3,5,10,14和21天各處死1隻小鼠。檢查橫膈、肝、腸係膜上有無膿腫,並做塗片和37℃厭氧培養。
2)星形奴卡菌和巴西奴卡菌移取整個菌落,置於無菌研缽中,加等量5%豬胃黏素,研磨成勻漿。取5隻小鼠,腹腔內注射各1ml接種液。其餘同以色列放線菌。
(4)臨床標本的接種從嚴重汙染的臨床標本中分離病源性真菌,取0.5~1ml臨床標本注入小鼠腹腔內,每周處死1隻,觀察5~6周。取肝、脾、腎和腦組織做病理切片和真菌培養。
4.接種方法接種的部位和途徑因研究目的不同而異。常用的接種部位有皮膚、皮下、口、胃、嗉囊、氣管內、靜脈、心內、陰道內、腦池、篩骨內。可根據不同的部位選擇接種途徑。皮膚接種常用於皮膚癬菌的接種。先將局部毛剃去,洗淨,乙醇消毒;再用紗布擦皮膚數下,以不出血為度,然後塗上菌液。齧齒類靜脈接種常選用鼠尾靜脈,接種量0.2ml。兔選擇耳緣靜脈,每次接種量為2ml。腹腔注射常選用小鼠、豚鼠和兔,小鼠接種量為0.5ml,豚鼠1~2ml,兔為2ml或更多。顱內注射常選用小鼠,接種量少於0.1ml。睾丸接種常選用豚鼠,將睾丸自腹腔擠入陰囊中,抓緊睾丸,局部消毒後注入0.1~0.2ml接種液於一側睾丸中。
5.感染後的處理動物接種後應標明接種的菌種名稱、接種量、接種途徑、接種日期和編號。接種動物應嚴加隔離,包括大、小便的嚴格管理。接種後要定期觀察至少4周,注意動物生活習慣的改變及症狀與體征的出現,每周處死1隻,並做好觀察記錄。
所有死亡動物都應立即剖檢,觀察期間仍存活的動物應麻醉後處死。解剖時應無菌操作。常規檢查的標本為肝、脾、腎和肺,也可根據需要選取其他的器官。采取的組織和器官應進行直接檢查、組織真菌培養和組織病理檢查,需要時應做特殊染色。所有使用過的手術器械、用具等均應置於消毒液中浸泡過夜,再清洗或在使用後直接高壓消毒。解剖後的動物屍體應高壓滅菌處理。
三、動物感染寄生蟲的實驗方法
動物感染寄生蟲實驗主要用於:①人體寄生蟲學研究;②進行人畜共患寄生蟲病的臨床醫學研究;③寄生蟲保種。感染方法如下。
(一)溶組織內阿米巴
1.動物2~4個月齡犬或貓,25~35g小鼠,或200~300g大鼠。
2.寄生蟲樣品用水洗沉澱法(或離心沉澱法)收集患者糞便中的溶組織阿米巴包囊,吸取沉澱物加盧戈碘液(碘:碘化鉀:蒸餾水為1:2:20)鏡檢。發現包囊即可備用。
3.感染方法
(1)選用健康的犬、貓或2月齡的大鼠,將沉澱法獲得的大量包囊拌入食物中飼喂(飼喂前使動物處在饑餓狀態)而致感染。
(2)選用健康的25~35g的小鼠或200~300g的大鼠用盲腸內注射法感染。將動物仰臥固定,乙醚麻醉,以無菌操作在腹左側做約0.5cm的一個切口,用8號針頭吸取經36~48h培養的溶組織內阿米巴滋養體0.3~0.5ml,(2~5)×105注入盲腸內,縫合腹壁。
4.結果檢查經口飼喂包囊的動物1~2周後,盲腸內注射包囊感染的動物5~7天,即可鏡檢糞便。必要時解剖動物,肉眼觀察腸壁病灶,同時用病灶局部腸壁黏液做塗片鏡檢滋養體。計算方法:1ml含原蟲數=1ml滴數×1滴的視野數×1個視野數。
(二)瘧原蟲
1.動物選擇體重18~22g的健康小鼠。
2.寄生蟲樣品準備用在紅細胞內期的瘧原蟲感染動物。可對種源鼠剪尾、摘除眼球或心髒穿刺取血,選薄血膜鏡檢每10個視野可見1~2個配子體,感染率在10%~20%的種源鼠作供血鼠。將含有瘧原蟲的血液用枸櫞酸鈉(2%)生理鹽水抗凝並稀釋成淡紅色血懸液備用。也可用瘧原蟲的子孢子感染動物。
3.感染方法
(1)血液感染用無菌的卡介苗注射器(1ml)吸取含有瘧原蟲的經抗凝稀釋後的血液0.2ml注入實驗小鼠的腹腔即可。
(2)蚊蟲傳染取實驗小鼠仰臥固定,腹部去毛,置入飼蚊籠內供饑餓24h的陽性蚊蟲叮刺1h,瘧原蟲的子孢子會通過蚊刺吸式口器從涎腺進入小鼠體內。也可用陽性蚊蟲的涎腺經研磨、離心處理後的上清液,立即取0.2ml注入小鼠尾靜脈或腹腔內,每25隻蚊子可感染100隻小鼠。
4.結果檢查小鼠感染3~4天後,剪尾采血塗片,經瑞氏染色用油鏡查找瘧原蟲。
(三)血吸蟲
1.動物選用2kg以上健康家兔、20g左右的小鼠或1kg以上的豚鼠。
2.寄生蟲樣本取容器一隻或數支放入數隻陽性釘螺,注入脫氨水至容器的2/3處,置於室溫25℃左右有陽光的環境或25℃溫箱內,經4~12h尾蚴可陸續從釘螺體逸出,並浮於水麵。容器內加網罩防止釘螺爬出丟失及汙染容器。在解剖鏡下用毛細滴管或細菌接種環吸或釣取尾蚴,經計數後置蓋玻片上(18mm×18mm)備用。
3.感染方法仰臥固定動物,腹部去毛5cm×5cm,用75%乙醇棉球消毒,夾取含有尾蚴的蓋玻片覆蓋於動物皮膚表麵,維持室溫25℃左右,並順蓋玻片緣滴於一小滴溫水使蓋玻片與動物皮膚之間保持濕潤。經15~20min移去蓋玻片,可見動物局部皮膚有針頭大小的充血點,此乃尾蚴鑽入皮膚所致的皮膚炎症反應。一般兔感染150條左右,小鼠35條左右,或者根據實驗要求酌情增減感染尾蚴的數量。
4.結果檢查動物自感染後35~40天即可在糞便中鏡檢到血吸蟲卵。通常用水洗沉澱法濃集蟲卵方法檢查。