第一節 動物交配及妊娠判別方法
一、動物的選擇
（一）種屬
理想中的生殖實驗動物最好能滿足以下條件：價格低廉、容易操作、受精率高、易於繁殖、產仔多、妊娠期短、易確定交配時間，自然死亡率和流產率低、檢查胎仔方便、對受試品反應敏感、代謝過程和胎盤的結構及功能盡可能與人一致、獲取的有效信息量大。至今，尚未發現有一種動物完全具備上述條件，也無一種動物模型對發育的反應與人類完全相同。因此，選擇實驗動物品種或種屬，應具體問題具體考慮，抓住需要解決的主要問題，兼顧其他。
（二）常用動物
1.小鼠孕期短而一致，產仔多，對致敏作用敏感，自發畸形率較低。交配率和受孕率較高。但小鼠的早期胎盤與人相差較大，是卵黃囊胚胎，這種胎盤類型和功能的差別可能對實驗結果產生影響，出現假陽性或假陰性結果。
2.大鼠具有小鼠同樣的優點。缺點是對致畸作用有較大的耐受性，實驗結果易出現假陰性。早期是卵黃囊胚胎，也可能出現假陽性。
3.兔其胎盤結構與人較接近，能更好地反映人體情況。但兔是草食動物，消化功能與人不同，不適合經口染毒。自發畸形率較高，孕期不一致。
人類以外的靈長類動物，種係上最接近人類，實驗結果與人存在良好的一致性。但此類動物來源困難，不易管理，價格昂貴，實驗周期長，故應用上存在很大的局限性。
實驗應選用性成熟的未交配過的健康動物進行。雌性小鼠生育年齡為50～60天，體重20～30g。雄性小鼠生育年齡為60天，體重20～35g。雌性大鼠生育年齡100天，體重200g。雄性大鼠生育年齡為100天，體重300g。雌兔生育年齡5～6個月，體重4.5kg。雄兔生育年齡為6～7個月，體重4kg。一般選用較大體重的動物進行交配比較容易受孕。
二、動物交配方法
（一）自然交配
1.齧齒類動物將大鼠或小鼠按雌：雄為2：1或1：1的比例，每天下午同籠，次日晨取出雄鼠，以4天或5天為一個周期（大鼠性周期為4～5天，小鼠性周期為4天）進行交配。
小鼠性成熟時期的標誌：母鼠陰道打開，陰道開放後出現求偶周期，有交配的欲望，樂意接近雄鼠；雄鼠睾丸下降，精子生成。為提高交配的成功率，必要時可用Whixtten法對雌鼠進行“預接觸”，在交配前2天，將一隻雄鼠放入5cm×4cm×4cm的封閉的柵欄筐，把鼠放在裝有10隻雌鼠的籠內。雄鼠和雌鼠一起生活2夜，第3天晚上，放出雄鼠，與雌鼠開始交配。經上述“預接觸”後的雌鼠，30%～40%可查見陰道栓。
交配在下午4：00時左右開始，雌雄2：1或1：1，關在同一籠子裏，最老的雌鼠先交配，根據需要確定交配的雌鼠數，當同一批的雌鼠交配結束後，雄鼠與下一批雌鼠交配。
2.兔
（1）交配健康性成熟的兔每月發情2次，每次持續3～5天。在發情期中，雌兔出現某些性情變化，例如，追逐騎跨等行為，外陰部出現黏膜水腫，變紅或變紫，這時適合交配。交配時將雌兔、雄兔從籠中取出，放在同一籠子裏，在雌兔與一隻雄兔交配完後，接著與另一隻雄兔交配或在第一次交配後相隔10～12h再與另一隻雄兔交配，複交可提高雌兔的受孕率。複交後的雌兔稱重，記錄交配日期和雌兔號。
（2）家兔交配注意事項①病兔或體弱兔不宜用於實驗；②正在換毛時體質較弱者不宜交配；③性未成熟兔不宜交配；④過肥或過瘦的兔不宜使用。
（二）人工授精技術
1.授精前的準備小鼠或大鼠一般不采用人工授精方法。兔多采用，人工授精法準確性高，方法可靠，可提高兔的受孕率。兔人工授精技術需要的設備和物品如下：①人工陰道和套管（1號乳膠導管）；②精液采集管（內徑13～14mm的離心管切斷至5cm長）；③K-Y膠狀物；④顯微鏡、消毒器、授精管；⑤黃體激素；⑥1ml注射器、6號注射針頭；⑦血球計數器、隔離衣；⑧血液稀釋吸管（紅細胞）、吸入裝置；⑨0.9%生理鹽水；⑩家兔。
2.雄兔精液的采集用左手將收集管放入人工陰道內，用K-Y膠狀液潤滑人工陰道，將左臂彎曲使兔的頭部放在左臂上騎跨一條腿，用右手抓住兔的頸背部，左手持人工陰道放在後腿之間戲逗。一般不超過1min雄兔即可射出精子，這時停止戲逗，回收小瓶，取出凝膠，將標本放入烘箱，直到能進行精子計數為止，立即進行精子計數。如果發現精子中含有血液或尿液時，此標本不能使用。好的標本為乳白色，清亮或稀薄的顏色少見。
3.采集精液注意事項
（1）采集精液的雄兔一般應在8個月齡以上。每周采集3次，每次1ml。精子的計數與總量應無明顯減少。
（2）采集精液前準備好所需設備，用肥皂水和清水徹底清洗，75%乙醇消毒血液吸量管和授精管，晾幹。
（3）人工陰道套管和采集管用於采集精液，套管是活動的，用橡皮筋捆在精液采集管的下半部，放入人工陰道內，人工陰道的套管的上半部加K-Y膠狀物，用皮筋加固套管，人工陰道內的大小和膠狀物必須合適，人工陰道太小可引起雄性損傷或引起疼痛使雄性受驚。
（4）采集精液前，人工陰道、生理鹽水、精液吸量管和采集管在烘箱內加熱到50℃，30～40min，人工陰道的溫度為40～50℃，溫度太高將引起精子損傷，同時也會引起雄性排尿，造成尿液對精子的汙染。
4.雌兔人工授精方法用一根幹淨溫暖的人工授精管，管內吸取0.25ml精液，操作者取坐姿，將雌兔放在兩膝之間，抓住雌兔頸背部，臀部皮膚放鬆，使兔背向人，用另一隻手抓住雌兔後腿，將尾巴向外拉起，暴露出外生殖器，用授精管的尖角插入陰道內，深度為授精管的1/4，當感覺有阻力時（可能在骨盆邊緣），180°緩慢轉動並繼續插入8～10cm，加壓活塞注入精液，用插入的同樣方式緩慢退出授精管，放下兔尾，如果在授精中雌鼠排尿，應重做，每隻雌兔人工授精需15～30min。授精的當天被認為時第0天，在妊娠30天處死。
5.人工授精注意事項
（1）雌兔人工授精前，經耳緣靜脈注入黃體激素1ml/kg，體積0.2ml/kg，以促進排卵，注射黃體激素後2h內進行人工授精。
（2）每隻雌兔給精液量為0.25ml，人工授精管的插入與拔出時注意操作要輕柔，以免損傷兔的陰道黏膜。
三、妊娠動物的判別
（一）陰道分泌物塗片檢查
雌鼠在正常情況下，每隔4天為一個性周期，一般發情後2～3天即可排卵。分娩後24h可受孕，這些變化是受卵巢功能所控製的。卵巢能分泌2類激素，一類是由卵巢顆粒細胞分泌的雌激素，另一類是由黃體細胞分泌的孕激素。雌激素的主要功能是刺激副性器官和乳腺的生長。動物在成年時期副性器官的發育、成熟和副性征的出現，以及在性周期內子宮內膜和陰道黏膜增生性的變化都依賴於雌激素的作用。小鼠發情期是雌激素分泌最旺盛時期，孕激素是子宮進行正常功能的主要激素。
1.動情周期的判別用顯微鏡觀察陰道液塗片可推知動情周期（4～5天）處於哪一階段。陰道液塗片的細胞學變化與晝夜周期有關。動情周期受中樞神經係統、情緒和腦垂體前葉控製。齧齒類動情周期依細胞學變化可分為以下幾個時期。
（1）動情前期生殖道內組成代謝活動增強，子宮充血腫脹，陰道口張開。陰道塗片中可見大量有核細胞和一些角化上皮細胞。此期持續時間約12h。
（2）動情期生殖道內組成代謝活動增強，外陰腫脹或充血，陰道口張開，陰道塗片可見大量有核細胞和角化上皮細胞，細胞分散，未成團成堆。此期持續時間約12h。
（3）動情間期緩慢生長的靜止期，陰道塗片見大量白細胞。此期約持續57h。
交配一般在動情前期的晚期或動情期的早期發生，這段時間持續較短（總共約24h），動情間期占整個4～5天周期的絕大部分。
2.陰道塗片的製取製取陰道塗片最好用一個小點滴管，用火焰將頭部燒光滑，口徑縮小。用點滴管吸幾滴生理鹽水，滴入陰道後再吸回，將滴管中的陰道衝洗液滴在載玻片上，空氣幹燥，蓋上蓋玻片，製成標本。可加點甲苯胺藍以提高反差，使細胞核清晰易辨。在低倍鏡下（40×）觀察細胞的類型，然後換成高倍（400×）鏡，細胞可能是有核細胞、角化（老的、無核的）上皮細胞或白細胞。有核上皮細胞通常呈卵圓形或多角形，有容易著色的明顯的細胞核，角化上皮細胞非常薄，有許多皺褶，可通過適當的染色加以識別。接近動情期時可能有一些黏液。觀察陰道塗片的組織學變化，可確定動情周期的不同階段。
在生殖或發育實驗時，交配期沒查到陰道栓（小鼠），或陰道塗片中未見到精子（大鼠）的雌鼠，一般需進行陰道黏膜細胞學檢查。因為大鼠和小鼠的動情周期4～5天，在交配期沒查到交配證據的雌鼠，可通過連續5天每天查陰道塗片，以確定動情周期是否正常。根據每天觀察到的細胞主要類型，判斷動物處於動情周期的哪一階段。
（二）陰道栓檢查
1.小鼠小鼠在交配後，於母鼠的陰道口形成一種白色的陰道栓，這種陰道栓的形成是因雄鼠的精液、雌鼠的陰道分泌物相混與陰道上皮等遇空氣迅速變硬，將陰道口封閉的結果。陰道栓一般在交配後12～24h自動脫落。由於小鼠交配後能產生這種特殊的陰道栓，所以常把檢查陰道栓的有無作為判斷是否交配的重要標誌。
交配後次日清晨，盡可能早地檢查雌鼠有無陰道栓，如陰道栓不易見到，需做深部檢查，用一把眼科鑷輕輕插入陰道，撐開陰道口，觀察有無陰道栓。未查到陰道栓的雌鼠放回繁殖群，查見陰道栓之日定為妊娠第0天。妊娠第0天時，將陰道栓陽性的雌鼠關在一起，每籠最多5隻，放在實驗室飼養。記錄小鼠的請領日期、編號、孕第0天體重、雄鼠編號和研究編碼，每隻交配成功的雄鼠也應做好記錄。
2.大鼠大鼠陰道栓一般在交配後2～8天自行脫落，故次日晨檢查時，在陰道內不易查見陰道栓，應查籠底盤內有無脫落的陰道栓。
（三）家兔妊娠診斷
家兔妊娠診斷一般用拇指和其餘四指輕輕按子宮部位進行摸胎，在交配後第10天，胎仔如黃豆大，第15天如白果大，第20天如胡桃大。能夠確定是否受孕的最早時間是在交配後第12天左右。假孕的診斷可用摸胎法診斷，也可觀察早期拉毛做窩現象進行判斷（一般交配後15天左右開始拉毛）。
（四）親代雄鼠精子活動度和精子計數分析
1.精子活動度判定
（1）取一側附睾迅速稱重後，置於1ml精子營養液中，剪碎附睾，在37℃下孵育15～20min，然後取少許精子懸液，充入血細胞計數池，在25～30℃條件下，用高倍鏡觀察精子活動度。同時按照精子泳動狀態將其分為4級。Ⅰ活動力良好：精子活動良好，呈直線遊動；Ⅱ活動力一般：精子活動比較活潑；Ⅲ活動不良：精子運動遲緩，原地打轉；Ⅳ死精子：有精子形態，但無活動力。
（2）取200個精子，計算精子活動率。整個過程在10min內完成。最後，將血細胞計數板加熱（60～80℃）數秒鍾，處死精子，用與紅細胞計數相同的方法，進行精子計數，然後根據每隻附睾的重量和稀釋倍數，求出每10ml附睾所含的精子數（百萬）。
2.親代雄鼠精子形態學試驗取一側附睾置於1ml 生理鹽水中，剪碎，用4層擦鏡紙過濾後，做精子懸液塗片、空氣幹燥、甲醛固定。用1%伊紅染色1h，自來水淋洗，幹燥後在高倍鏡下觀察精子形態，每鼠計數1000個精子，計算畸形精子的百分率。畸形精子包括無定性、無鉤、香蕉形、胖頭、雙頭、尾折疊、雙尾等類型。