1.凍存方法在凍存前，應選好腫瘤組織或細胞係。將對數增值期的細胞或腹水瘤細胞經消化脫壁後，用培養液洗滌1次。配合含有保護劑（10%～15%的DMSO，甘油等）的培養液作為細胞凍存液。以腫瘤細胞在細胞凍存液中的密度為1×107個細胞/ml左右懸浮細胞。準備凍存的細胞懸液加入到2ml塑料凍存管內。將凍存管放入4℃或-30℃低溫冰箱內2h後，移入液氮罐內長期保存。
2.凍存細胞的複蘇
（1）將凍存的腫瘤細胞凍存管從液氮罐內取出，立即置於37～40℃溫水中，使凍存細胞在1min內全部融化。
（2）用1000r/min，離心10min，棄去上清液，用新鮮培養液稀釋到所需細胞數，再進行培養。
（三）實體瘤動物模型的建立
1.器械與試劑
（1）無菌室和超淨工作台。
（2）外科手術器械。
（3）消毒用碘酒、乙醇。
2.實驗方法
（1）小塊瘤體接種法從動物體內剝離取出腫瘤後，剔除非腫瘤組織和壞死組織，選取生長良好而無變性壞死、呈淡紅色（黑色素瘤則呈黑色或黑紫色）魚肉狀的瘤組織，切成5mm×5mm×5mm的小塊，在所選宿主動物的腋下剪開一個小口，用無鉤眼科鑷子夾取小塊，送入切口內皮。腋下部皮膚鬆弛，能使腫瘤生長得很大，宿主動物的壽命也可延長。
（2）腫瘤細胞懸液接種法將選取的腫瘤組織放入玻璃勻漿器中，用無菌生理鹽水研磨後，經濾網過濾成單個的細胞懸液，用台盼藍染色法計數活細胞數，每個接種點以0.2ml，1×106～1×107個細胞數用1ml的皮下注射器注射到接種部位，每隻動物可選用多個接種點，通常接種於腋下部皮下。癌細胞數過多，接種後瘤體生長過快，不便於受試物作用的觀察，癌細胞數過少，會導致接種失敗，接種部位不能形成腫瘤，此時在原動物體內再重新接種也難成功，必須重新更換動物。製備腫瘤懸液，在研磨時必須使研磨杆向同一方向轉動，不可反向交替研磨，防止磨破腫瘤細胞；如果采用電動研磨，一定要控製好轉速，以免破壞完整的腫瘤細胞。
（3）培養細胞動物體內移植法將培養至快要融合的單層細胞（對數生長期）用0.25%胰蛋白酶消化脫壁後，經用PBS或生理鹽水以1000r/min經10min離心洗滌2次後，洗掉細胞中胰蛋白酶和培養液中血清等成分，用台盼藍染色法計數活細胞數，用生理鹽水將腫瘤細胞稀釋成1×106～1×107濃度，細胞懸液置於冰上，每個接種點以0.2ml，1×106～1×107個細胞數，用1ml的皮下注射器盡快注射到動物體內接種部位。
（4）活細胞計數方法用新鮮配製成0.05%伊紅或0.1%台盼藍生理鹽水溶液，將腫瘤細胞懸液稀釋，混勻後在血球計數板上計數，染色者為死細胞，不染色為活細胞。
3.實驗結果
（1）實體瘤測量方法對於實體瘤的測量，有許多種方法。主要有測定腫瘤的質量、體積或直徑等方法。通常於停藥之後次日處死動物，立即剝離取出瘤塊，剔除其他組織後稱重。若對照組小鼠腫瘤平均＜1g或20%小鼠的瘤重＜400mg，表示腫瘤生長不良。在治療期間給藥組小鼠死亡率＞20%或平均體重下降（自身對照）超過15%者，表示受試物毒性反應，應適當減量重複試驗，比較試驗組與對照組瘤重的差異，按下列公式計算腫瘤抑製率。
腫瘤抑製率=對照組瘤重-給藥組瘤重對照組瘤重×100%
（2）瘤體的測量測量瘤體，不需處死動物，用遊標千分卡尺測量腫瘤的3個互相垂直的直徑（包括皮膚的厚度在內），取它們的平均值即為平均直徑。
（四）非實體瘤動物模型的建立
以腹水瘤為例，腹水瘤移植接種方法如下。
1.器械與試劑同上。
2.動物小鼠6～7周齡，體重18～22g的健康小鼠。每批動物隻用一種性別，腹水型腫瘤一般用雌性動物接種。
3.實驗方法取出小鼠接種後第5～7天的腹水，用生理鹽水稀釋到1×106～1×107個細胞數，用1ml的皮下注射器注入動物腹腔，一般接種量為0.1～0.2ml。腹水瘤的傳代方法與移植接種方法一樣。腫瘤移植應嚴格無菌操作，接種時間應盡可能短，不應超過半小時。
4.腹水瘤測量方法腹水瘤的測量方法是對小鼠進行每天1次的稱量體重，然後進行自身對照或用空白對照進行比較，觀察體重的變化。
5.腹水型腫瘤療效評價一般在療程結束後次日稱體重，逐日記錄。通常對照組在2～3周內死亡，若治療期間對照組動物死亡大於等於20%或其20%存活時間長於4周以上，實驗均為作廢。治療組觀察時間一般為50天左右，按下列公式計算生命延長率。
生命延長率=治療組評價存活天數-對照組平均存活天數對照組平均存活天數×100%
非腹腔給藥時生命延長率＞50%，腹腔給藥時，生命延長率＞75%，則認為有療效，連續3次，療效穩定，則評價此受試物有一定療效。
四、免疫熒光細胞化學染色法
免疫熒光細胞化學是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素製成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。免疫熒光細胞化學分為直接法、間接法和補體法。
（一）標本製作
經過塗片、印片、細胞單層培養物、組織切片等步驟，經適當固定或不固定，做免疫熒光染色用。
（二）直接法
直接法比較簡單，適合做細菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體隻能檢查一種相應的抗原，特異性高而敏感性較低。
1.染色切片經固定後，滴加經稀釋至染色效價如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ——球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等），在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內，防止幹燥。
2.洗片傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH值7.4或pH值7.2PBS中洗2次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結晶。
3.固定用50%緩衝（0.5mol/L碳酸鹽緩衝液pH值9.0～9.5）甘油封固、鏡檢。
4.對照染色①正常免熒光血清染色，如上法處理切片，結果應為陰性。②染色抑製試驗（一步法）：將熒光抗體和未標記的抗體球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法處理切片。結果應為陰性。為證明此種染色抑製不是由於熒光抗體被稀釋所致，可用鹽水代替未標記抗血清，染色結果應為陽性。此法結果較二步法穩定。③類屬抗原染色試驗（略）。
（三）間接法
間接法隻需製備一種熒光抗體可以檢出多種抗原，敏感性較高，操作方法較易掌握，而且能解決一些不易製備動物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查，所以已被廣泛應用於試驗。又分為雙層法和夾心法。
1.雙層法
（1）染色切片固定後用毛細滴管吸取經適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置於染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然後用0.01mol/l pH值7.2PBS洗2次，10min，用吸水吸去或吹幹餘留的液體。
（2）洗片再滴加間接熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等），同上步驟，染色30min、37℃，緩衝鹽水洗2次10min，攪拌，緩衝甘油封固，鏡檢。
（3）對照染色①抗體對照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進行染色，結果應為陰性。②抗原對照：即類屬抗原染色，亦應為陰性。③陽性對照。
2.夾心法即用未標記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應抗體結合，再用該抗原之熒光抗體重疊結合其上，而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在，方法步驟如下：①切片或塗片固定後，置於染色濕盒內；②滴加未標記的特異性抗原作用切片於37℃、30min；③緩衝鹽水洗2次，每次5min，吹幹；④滴加特異性熒光抗體再用切片於37℃、30min；⑤如③水洗；⑥緩衝甘油封固，鏡檢。
（四）補體法
本法之熒光抗體不受免疫血清的動物種屬的限製，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應用，敏感性亦較間接法高，效價低的免疫血清亦可應用，節省免疫血清，尤其是對檢查形態小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質時甚為理想。
1.材料
（1）免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers 鹽水做2倍稀釋成1：2，1：4，1：8……。補體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補體熒光抗體等，按下述的補體法染色。免疫血清補體結合的效價，如為1：32則免疫血清應做1：8稀釋。
（2）補體用新鮮豚鼠血清，一般做1：10稀釋或按補體結合反應試管法所測定的結果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH值7.4、0.1mol/L 的磷酸緩衝鹽水中，溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。
（3）抗補體熒光抗體：在免疫血清效價為1：4，補體為2單位的條件下，用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價，然後按染色效價1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。
2.方法步驟
（1）塗片或切片固定。
（2）吸取經適當稀釋之免疫血清及補體之等量混合液（此時免疫血清及補體又都稀釋一倍）滴於切片上，37℃作用30min，置於保持一定濕度的染色盒內。
（3）用緩衝鹽水洗2次，攪拌，每次5min，吸幹標本周圍水液。
（4）滴加經過適當稀釋之抗補體熒光抗體30min、37℃，水洗同（3）。
（5）蒸餾水洗1min，緩衝甘油封固。
3.對照染色
（1）抗原對照。
（2）抗血清對照：用正常兔血清代替免疫血清。
（3）滅活補體對照：將補體經56℃、30min處理後，按補體同樣比例稀釋，與免疫血清等量混合後，進行補體法染色。
（五）染色法
1.膜抗原熒光抗體染色法本法應用直接法或間接法的原理和步驟，可對活細胞在試管內進行染色，常用於T和B細胞、物、瘤細胞抗原和受體等的檢查和研究，陽性熒光主要在細胞膜上。FACS即采用此法原理。
2.雙重染色法在同一標本上有2個抗原需要同時顯示（如A抗原和B抗原），A抗原的抗體用FITC標記，B抗原的抗體用羅達明標記，可采用以下染色方法。
（1）一步法雙染色先將2種標記抗體按適當比例混合（A+B），按直接法進行染色。
（2）二步法雙染色先用RB200標記的B抗體染色，不必洗去，再用FITC標記的A抗體染色，按間接法進行。
結果：A抗原陽性熒光呈現綠色，B抗原陽性呈現橘紅色熒光。
3.熒光抗體再染色法若切片或其他標本經某種熒光抗體染色後，未獲得陽性結果，而又疑有另外的病原體存在時，可用相應的熒光抗體再染色。有時存檔蠟塊不能再用以切片，也可用存檔的HE染色標本，褪去蓋片和顏色，再做免疫熒光或其他免疫細胞化學的染色。
4.熒光抗原染色法某些抗原可以用熒光素標記，製成熒光抗原，標記熒光素的方法與製備熒光抗體方法相同。用熒光抗原可以直接檢查細胞或組織內的相應抗體，特異性較好，敏感性較差。染色方法同熒光抗體染色的直接法。由於多數抗原難以提純或量少，一般很少采用此法。
五、活細胞免疫熒光技術——流式細胞儀標本的製備
流式細胞儀（flow cytometry，FCM）是一種可以對細胞或亞細胞結構進行快速測量的新型分析技術和分選技術。FCM以它的快速、靈活及定量的特點被廣泛地應用於免疫學的基礎研究和臨床應用的各個方麵，尤其是結合單克隆抗體技術，在免疫分型、分選、腫瘤細胞的免疫監測、機體免疫狀態的監測、免疫細胞的係統發生及特性研究等方麵更能起到重要作用，成為現代免疫技術的重要組成部分。
（一）原理
活細胞表麵保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表麵相應抗原結合，再用熒光標記的第二抗體結合，根據所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布。
（二）試劑和器材
1.各種特異性單克隆抗體。
2.熒光標記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。
3.10%FCS RPMI1640，DPBS、洗滌液、固定液。
4.玻璃管、塑料管、離心機、熒光顯微鏡等。
（三）操作步驟
（四）注意事項
1.整個操作在4℃下進行，洗滌液中加有比常規防腐劑量高10倍的NaN3，上述實驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原後發生交聯、脫落。
2.洗滌要充分，以避免遊離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結合，出現假陰性。
3.加適量正常兔血清可封閉某些細胞表麵免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。
4.細胞活性要好，否則易發生非特異性熒光染色。
第二節 微生物學研究中的動物實驗方法
一、動物感染病毒的接種方法
病毒缺少自我繁殖能力，必須依賴宿主細胞進行繁殖，各種活體動物及禽類的胚胎都可供病毒大量繁殖，是用來繁殖病毒的主要手段。常用的動物有大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠、兔等。
（一）接種途徑、方法及接種量
動物感染病毒的接種途徑包括皮內接種、皮下接種、肌內接種、腹腔接種、靜脈接種、腦內接種、經口接種等。各種動物不同接種途徑的注射方法簡要敘述如下。
1.皮內接種指將接種物注入皮層內。選用帶4號針頭的卡介苗注射器，一般每點注入0.1～0.2ml。注射後接種部位鼓起小包，表麵蒼白，表明注射正確。
2.皮下接種指將接種物注射在皮下結締組織層內。小鼠、兔多選擇頸背部皮膚較薄處接種，背部皮膚較厚的動物如豚鼠、大鼠、犬、貓，接種不易操作的，通常豚鼠在大腿內側，大鼠在下腹部，犬和貓在大腿外側。
3.肌內接種指將接種物注入肌肉之中。肌內注射吸收快，肌肉感覺神經比皮下少，較皮下注射疼痛輕。通常大鼠、小鼠選擇腹部，犬、兔、貓、猴選擇臀部或股部，禽類選用胸肌，注意不要將針頭紮入胸腔內。
4.腹腔接種指將接種物注射到腹腔內。操作時使動物頭部低於尾部，腹部朝上，這樣動物腹腔器官就會前移，避免紮傷腹部髒器，通常在臍後近腹白線處進針，由皮下斜刺入。注射量：小鼠0.2～0.4ml，大鼠2～4ml，兔3～5ml。