第五節 安全藥理學試驗中的動物實驗方法
安全藥理學（safety pharmacology）主要是研究藥物在治療範圍內或治療範圍以上的劑量時，不期望出現的對生理功能的不良影響，即觀察藥物對中樞神經係統、血管係統和呼吸係統的影響。其目的是：確定藥物可能關係到人的安全性的非期望藥理作用；評價藥物在毒理學和（或）臨床研究中所觀察到的藥物不良反應和（或）病理生理作用；研究所觀察到的和（或）推測的藥物不良反應機製。
一、動物實驗方法
1.受試物受試物應與藥效學或毒理學研究的一致，外用藥物和注射劑一般以製劑作為受試物，並附研製單位的自檢報告。
2.實驗動物常用小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、犬等動物。小動物每組不少於10隻，大動物每組不少於6隻。動物雌雄各半。動物選擇與試驗方法相匹配，同時還應注意品係、性別及年齡等因素。盡量采用清醒動物。如使用麻醉動物，應注意麻醉藥物的選擇和麻醉深度的控製。
3.對照一般可選用溶媒和（或）輔料做對照、陽性對照組。
4.劑量劑量應包括或超過主要藥效學的有效劑量或治療範圍。如果缺乏不良反應的結果，試驗的最高劑量應設定為相似給藥途徑和給藥時間的其他毒理試驗中產生中等強度不良反應的劑量。在安全藥理學的檢測指標未產生不良反應時，在限製劑量的情況下，可以采用單一劑量。體外研究應確定受試物的濃度——效應關係。
5.給藥途徑與次數一般采用單次給藥。采用與臨床擬用途徑一致的給藥途徑。如果有多個臨床擬用途徑時，分別采用相應的給藥途徑。
6.觀察時間結合受試物的藥效學和藥代動力學特性、受試動物、臨床研究方案等因素選擇觀察時間點和觀察時間。
二、主要研究內容
（一）核心組合試驗
核心組合試驗的目的是研究受試物對重要生命功能的影響，即對中樞神經係統、心血管係統、呼吸係統重要器官係統的影響。
1.中樞神經係統定性和定量評價給藥後動物的運動功能、行為改變、協調功能、感覺/運動反射和體溫等的變化。
2.心血管係統測定給藥前後血壓（收縮壓、舒張壓和平均壓）、心電圖（QT間期、PR間期、S-T段和QRS波等）和心率等的變化。
3.呼吸係統測定給藥前後動物的呼吸頻率和呼吸深度等的變化。
（二）追加和（或）補充的安全藥理試驗
當核心組合試驗、臨床試驗、流行病學、體內外試驗以及文獻報道提示藥物存在潛在的與人體安全性有關的不良反應時，應進行追加和（或）補充的安全藥理學研究。
1.追加的安全藥理學試驗
（1）中樞神經係統行為、學習記憶、神經生化、視覺、聽覺和（或）電生理等指標。
（2）心血管係統心輸出量、心肌收縮作用、血管阻力等指標。
（3）呼吸係統氣道阻力、肺動脈壓力、血氣分析等指標。
2.補充的安全藥理學試驗
（1）泌尿/腎髒係統觀察藥物對腎功能的影響，如尿量、密度、滲透壓、pH值、電解質平衡、蛋白質、細胞和血生化（如尿素氮、肌酐、蛋白質）等指標。
（2）自主神經係統觀察藥物對自主神經係統的影響，如與自主神經係統有關受體的結合、體內或體外對激動劑或拮抗劑的功能反應、對自主神經的直接刺激作用和對心血管反應、壓力反射和心率等指標。
（3）胃腸係統觀察藥物對胃腸係統的影響，如胃液分泌量和pH值、胃腸損傷、膽汁分泌、體內轉運時間、體外回腸收縮等指標。
三、數據處理與結果評價
選用合適的統計方法，對數據進行定性和定量分析。同時結合藥效、毒理、藥代動力學以及其他研究資料進行綜合評價，為臨床研究提供參考。
第六節 生殖毒性試驗中的動物實驗方法
生殖毒性試驗（reproduction toxicity study）是通過動物實驗反映受試物對哺乳動物生殖功能和發育過程的影響，預測其可能產生的對生殖細胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等親代生殖功能的不良影響，以及對子代胚胎——胎仔發育、出生後發育的不良影響。
一、動物實驗方法
（一）受試物
受試物應采用製備工藝穩定、符合臨床研究用質量標準規定的樣品，並注明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規格）、保存條件及配製方法等，並附有研製單位的自檢報告。所用輔料、溶媒等應標明批號、規格和生產廠家，並符合試驗要求。
（二）實驗動物
采用與其他毒理學試驗相同種屬和品係的哺乳動物進行試驗。齧齒類動物首選大鼠，非齧齒類動物首選家兔。選用年輕、性成熟的成年動物，雌性動物未經產。動物初始體重差異在平均體重20%以內。動物應符合國家有關規定的等級要求，來源、品係、遺傳背景清楚，並具有實驗動物質量合格證。
（三）動物分組
1.一般生殖毒性試驗動物分組至少設2個劑量組，以及1個溶劑對照組和1個陽性對照組（必要時）。每組雄性動物20隻，雌性動物20隻以上。
2.致畸敏感期毒性試驗動物分組設立3個劑量組，1個溶劑對照組（必要時）、1個空白對照組和1個陽性對照組，各組的雌鼠數依據研究需要和已查到陰道栓的雌鼠數確定，為保證每組孕鼠達到20隻以上，一般每組準備30隻雌鼠，15隻雄鼠用於交配。家兔每組雄性10隻，雌性20隻用於交配（或人工授精），以保證得到足夠的孕兔。
3.圍生期毒性試驗動物分組設高、中、低3個劑量組，1個溶劑對照組、1個陽性對照組（必要時）、1個空白對照組（必要時）每組需雄鼠15隻，雌鼠30隻或雄兔10隻，雌兔20隻。
（四）給藥方法
1.給藥途徑原則上與推薦臨床應用的給藥途徑相同。但致畸敏感期毒性試驗不宜采用腹腔注射，口服製劑除灌胃外，還可在嚴格測定其消耗量的前提下自由攝取或在飲水、飼料中投入。
2.給藥時間一般生殖毒性試驗，在交配前雄28～80天，雌性14天，連續給藥。雌性動物交配後繼續給藥至多數器官形成期；致畸敏感期毒性試驗，於胚胎器官形成期連續給藥，大鼠孕後6～15天，小鼠5～15天，家兔6～18天；圍產期毒性試驗，大鼠和小鼠於妊娠第15天開始給藥，至分娩後21天（小鼠）和28天（大鼠）。家兔於妊娠期第22天開始給藥，至分娩後31天。
3.給藥體積各種動物一次灌胃能耐受的最大容積和不同途徑給藥的常用注射量。
（五）觀察指標
1.給藥期間一般狀態觀察給藥期應檢查每隻動物出現的各種毒性跡象，如活動抑製、嗜眠症、旋轉等行為異常及腹瀉，糞便、尿液或分泌物中帶血，或其顏色改變，腫脹、腫塊、損傷、皮毛粗糙、眼睛分泌物多、動物體重減輕等現象。給藥後一般觀察1～2h。
2.一般生殖毒性試驗觀察指標
（1）雌鼠飲水量、食物耗量、死亡數及一般健康情況。每周稱體重一次、觀察交配行為，計算受孕率等。
（2）雄鼠給藥期間飲水量、食物耗量、體重變化情況；交配後處死、取附睾精子進行精子活動度、精子計數和精子形態觀察；稱睾丸、附睾重量，計算重量係數、生育率等；睾丸組織送病理檢查。
（3）孕鼠分別在妊娠第0、6、12和18天稱體重，第14天每組處死10隻，檢查統計受孕率、著床前死亡率、著床後死亡率等。
（4）仔鼠出生後24h內，計算死、活仔鼠數；稱體重，觀察性別比例及外觀畸形；第4天時剔除多餘仔鼠，使各窩仔鼠數等於8，少於6隻仔鼠的窩棄之不用。第0、4、7、14、21、28和35天稱重，記錄仔鼠生存情況；斷乳時處死，解剖檢查內髒畸形。
3.致畸胎試驗觀察指標一般觀察指標包括黃體、著床數、胎塊、晚死胎、活胎、母體增重等。
（1）胎仔的外觀檢查觀察有無腦積水、露腦、腦膜膨出、無眼、小眼、無耳、齶裂等頭部畸形。有無多趾、並趾、無趾、足內翻、短肢等四肢畸形。有無臍疝、腹裂、脊髓膨出、脊柱裂、脊柱側突等軀幹畸形。有無短尾、卷尾、無尾、尾分叉等尾畸形，有無肛門閉鎖等。
（2）骨骼檢查觀察頭顱是否完整，骨化程度；有無胸骨節缺失、骨化不全、雙骨化點、胸骨節錯位、多肋、少肋、肋骨分叉、肋融合、波狀肋等。有無四肢骨化不全、粗短、畸形、多趾（指）、少趾（指）等。
（3）器官檢查觀察有無齶裂、舌異常；有無鼻道擴大、單鼻道等。眼球大小是否正常，有無腦水腫、腎積水等；心、肝、脾、肺、腎、子宮、睾丸等髒器大小位置等有無異常。
4.圍生期毒性試驗觀察指標
（1）母鼠體重、飲水量、攝食量、妊娠分娩時間、產仔數、受孕率、死亡率等。
（2）仔鼠外觀畸形、幼仔出生存活率、哺育成活率、性別比例、生長指數等；斷乳時處死檢查心、肺、肝、脾、腎、睾丸或子宮的重量及內髒畸形。
（3）仔鼠生育發育和斷乳前神經行為發育測試指標。
生理發育指標出生後時間（天）神經發育指標出生後時間（天）耳郭分離1～平麵翻正2～出毛3～運動狀況4～門齒萌出6～負趨地性5～張耳6～懸崖回避5～睜眼10～觸須定位10～睾丸下降20～空中翻正13～陰道張開30～視覺定位15～
（4）仔鼠斷乳後行為測試指標①光電活動籠測試，記錄F1小鼠自發活動次數；②轉棒試驗，檢測F1小鼠協調運動功能；③遊泳衰竭時間測試，觀察低溫情況下F1仔鼠被動運動能力；④“Y”形迷宮測試，檢測F1小鼠學習記憶能力；⑤生殖行為試驗，了解F1小鼠交配行為及受孕率。
二、結果分析和評價
（一）一般生殖毒性試驗統計指標及數據處理
一般生殖毒性試驗統計指標包括如下內容。
1.雌鼠實驗動物數、飲水量、食物消耗量、死亡動物數、體重（每周稱一次）、受孕率等。同時注意觀察雌鼠一般健康情況和交配行為等。
2.雄鼠實驗動物數、飲水量、食物消耗量、死亡動物數、體重（每周稱一次）、生育率。必要時檢查精子活力、精子數量、精子畸形率、睾丸（附睾）重量、睾丸（附睾）重量係數、睾丸病理檢查結果。
3.孕鼠體重、妊娠率、著床前死亡率、著床後死亡率、平均著床數。
4.仔鼠死仔鼠數、活仔鼠數、仔鼠總數、性別比例、外觀畸形仔鼠數、外觀畸形率、體重（分別在第0、4、7、14、21、35天時稱）。仔鼠哺乳期存活情況、斷乳時內髒檢查。
5.數據統計處理方法受孕率、生育率、胎鼠畸形率、胎鼠性別等計數資料用χ2檢驗；體重等計量資料用t檢驗；著床前死亡率或以著床數為單位的死胎率作反正弦變化後進行t檢驗；各組胎鼠平均體重用方差分析，若各組均數間差別有顯著性，進一步用Dunnett 檢驗分析；精子畸形率以等級秩和檢驗統計處理。各組試驗仔鼠斷乳前以窩為單位統計，斷乳後以個體單位統計。
（二）致畸敏感期毒性試驗的統計指標及數據處理
1.對各組母動物需統計的指標
（1）實驗動物數。
（2）交配成功動物數及交配率。
（3）死亡動物數及死亡率。
（4）剖檢母動物數：①剖檢母動物的平均體重及孕期體重增長值或母體增重；②平均妊娠黃體數；③平均著床數；④有畸胎的動物數及畸胎率。
2.各組胎仔需統計的指標平均活胎數及活胎率、吸收胎數和吸收胎率、死胎數和死胎率、性別比例、平均活胎體重（雌雄分別統計）、進行外觀、骨骼、內髒檢查的胎仔數及其畸形胎仔數、外觀畸形率、骨骼畸形率、內髒畸形率、枕骨骨化程度。
3.數據統計方法不同指標用不同的顯著性檢驗方法處理。平均體重、平均黃體數、平均著床數、平均活胎數、平均活胎體重用t檢驗；妊娠率、交配率、受孕率、活胎率用χ2檢驗；胎吸收率、死胎率、畸胎率用非參數統計。可能時計算劑量——效應關係。
（三）圍生期毒性試驗的統計指標及數據處理
圍產期毒性試驗時，可根據試驗設計選做如下指標，並做相應的統計分析處理。
1.母鼠體重、飲水量、攝食量、妊娠分娩時間、產仔數、受孕率、死亡率等。
2.仔鼠外觀畸形數、外觀畸形率、出生存活率、哺育成活率、性別比例、生長指數等。斷乳時處死，檢查心、肺、肝、脾、腎、睾丸或子宮的重量及內髒畸形的類型和數量。
3.仔鼠生理發育和斷乳前神經行為發育測試指標耳郭分離、出毛、門齒萌出、張耳、睜眼、睾丸下降、陰道張開、平麵翻正、運動狀況、負趨地性、懸崖回避、觸須定位、空中翻正、視覺定位等。
4.仔鼠斷乳後行為測試指標光電活動籠測試、轉棒運動測試、遊泳衰竭時間測試、“Y”形迷宮測試、生殖行為試驗等。
5.統計方法受孕率、外觀畸形率、胎鼠性別等計數資料用χ2檢驗；體重等計量資料用t檢驗；仔鼠斷乳前以窩為單位統計，斷乳後以個體為單位統計。