5.觀察時間及指標給藥後，一般連續觀察至少14天，給藥當天，尤其是給藥4h內應嚴密觀察，然後每天上、下午各一次。觀察毒性反應出現的時間及其恢複時間、動物死亡時間等。觀察的指標包括一般指標（如動物外觀、行為、對刺激的反應、分泌物、排泄物等）、動物死亡情況（死亡時間、瀕死前反應等）、動物體重變化（給藥前、試驗結束處死動物前各稱重一次，觀察期間可多次稱重）等。記錄所有的死亡情況、出現的症狀，以及症狀起始的時間、嚴重程度、持續時間等。
6.病理學檢查所有的實驗動物均應進行大體解剖，包括試驗過程中因瀕死而處死的動物、死亡的動物以及試驗結束時仍存活的動物。任何組織器官出現體積、顏色、質地等改變時，均應記錄並進行組織病理學檢查。
二、結果處理和分析
根據所觀察到的各種反應出現的時間、嚴重程度、持續時間等，分析各種反應在不同劑量時的發生率、嚴重程度。對結果歸納分析，判斷每種反應的劑量——反應及時間——反應關係。
判斷出現的各種反應可能涉及的組織、器官或係統等。
根據大體解剖中肉眼可見的病變和組織病理學檢查的結果，初步判斷可能的毒性靶器官。組織病理學檢查應附有病變組織的病理照片。
根據各種毒性反應及發生率、動物死亡情況等，采用適當的試驗方法來測定最大無毒性反應劑量或最小毒性反應劑量，最大耐受劑量或近似致死量或最小致死劑量等，初步判斷受試物的安全範圍。
急性毒性試驗中常用實驗方法如下。
（一）近似致死劑量法
該方法主要用於非齧齒類的動物實驗。一般采用6隻健康的Beagle犬或猴。犬的年齡一般為4～6個月齡，猴的年齡一般為2～3歲。
根據小動物的毒性試驗結果、受試物的化學結構和其他有關資料，估計可能引起毒性和死亡的劑量範圍。按50%遞增法，設計出含數個劑量的劑量序列表。由劑量序列表中找出可能的致死劑量範圍，在此範圍內，每間隔一個劑量給一隻動物，測出最低致死劑量和最高非致死劑量，然後用二者之間的劑量給一隻動物。如果該劑量下動物未發生死亡，則該劑量與最低致死劑量之間的範圍為近似致死劑量範圍；如果該劑量下動物死亡，則該劑量與最高非致死劑量間的範圍為近似致死劑量範圍。
（二）最大給藥量法
對於某些低毒的受試物可采用該方法。在合理的最大給藥濃度及給藥容量的前提下，以允許的最大劑量單次給藥或24h內多次給藥（劑量一般不超過5g/kg體重），觀察動物出現的反應。一般使用10～20隻動物，連續觀察14天。
（三）固定劑量法
該方法不以死亡作為觀察終點，而是以明顯的毒性體征作為終點進行評價。試驗選擇5mg/kg、50mg/kg、500mg/kg和2000mg/kg 4個固定劑量進行試驗，特殊情況下可增加5000mg/kg劑量。實驗動物首選大鼠，給藥前禁食6～12h，給受試物後再禁食3～4h。采用一次給藥的方式進行。如無資料證明雄性動物對受藥試物更敏感，首先用雌性動物進行預試驗。從上述4個劑量中選擇一個作為初始劑量；一般用500mg/kg作為初始劑量進行預試，如無毒性反應，則用2000mg/kg進行預試驗，此劑量如無死亡發生即可結束預試驗。如初始劑量出現嚴重的毒性反應，即降低一個檔次的劑量進行預試，如此時動物存活，就在此2個固定劑量之間選擇一個中間劑量試驗。每個劑量給一隻動物，預試驗一般不超過5隻動物。每個劑量試驗之間至少應間隔24h。給受試物後的觀察期至少7天，如動物的毒性反應到第7天仍然存在，應繼續觀察7天。
在上述預試驗的基礎上進行正式試驗。每個劑量至少用10隻動物，雌雄各半。根據預試驗的結果，在上述4種劑量中選擇一個可能產生明顯毒性但又不引起死亡的劑量進行試驗。給受試物後至少應觀察2周，根據毒性反應的具體特點可適當延長觀察時間。
（四）上下法
該法最大的特點是節省實驗動物，同時可以進行毒性症狀的觀察、估算LD50及其可信限，適合能引起動物快速死亡的藥物。該方法分為限度試驗和主試驗。限度試驗主要用於有資料提示受試物毒性可能較小的情況。在相關毒性資料很少或沒有時，或預期受試物有毒性時，應進行主試驗。
1.限度試驗最多用5隻動物進行的序列試驗。試驗劑量為2000mg/kg，特殊情況下也可使用5000mg/kg。
（1）2000mg/kg劑量水平的限度試驗將受試物給予1隻動物。如果該動物死亡，則進行主試驗；如果該動物存活，依次將受試物給予另外4隻動物，如果有3隻動物死亡，則進行主試驗。
（2）5000mg/kg劑量水平的限度試驗特殊情況下，可使用5000mg/kg的劑量。將受試物給予1隻動物。如果該動物死亡，則進行主試驗；如果該動物存活，將受試物給予另外2隻動物。如果這2隻動物都存活，則LD50大於5000mg/kg，停止試驗（即不再對其他動物給藥，觀察14天）。如果這2隻動物中有1隻死亡或者2隻均死亡，將受試物給予另外2隻動物，一次1隻。如果1隻動物在試驗後期死亡，而其他動物存活，應停止對其他動物給藥，對所有動物進行觀察，是否在相似的觀察期間也發生死亡。後期死亡的動物應與其他死亡的動物同樣計數，對結果進行如下評價。有3隻或3隻以上動物死亡時，LD50小於5000mg/kg；有3隻或3隻以上動物存活時，LD50大於5000mg/kg。
2.主試驗由一個設定的給藥程序組成，在此程序中，每次給藥1隻動物，間隔至少48h。給藥間隔取決於毒性出現時間、持續時間和毒性的嚴重程度。在確信前一隻動物給藥後能存活之前，應推遲按下一劑量給藥。時間間隔可以適當調整，但使用單一時間間隔時，試驗會更簡便。
第一隻動物的給藥劑量低於LD50的最接近的估計值。如果該動物存活，第二隻動物給予高一級劑量；如果第一隻動物死亡或出現瀕死狀態，第二隻動物給予低一級劑量。劑量級數因子應選定為1/（劑量-反應曲線斜率估計值）的反對數（對應於斜率2的級數因子為3.2），並應在整個試驗過程中保持不變。當沒有受試物的斜率的有關資料時，使用3.2為劑量級數因子。使用默認級數因子時，劑量應從以下序列中選擇：1.75mg/kg、5.5mg/kg、17.5mg/kg、55mg/kg、175mg/kg、550mg/kg、2000mg/kg（或有特殊要求時1.75mg/kg、5.5mg/kg、17.5mg/kg、55mg/kg、175mg/kg、550mg/kg、1750mg/kg、5000mg/kg）。如果沒有受試物的致死估計值，應該從175mg/kg開始。如果預期動物對該受試物的耐受程度變化很大（即，估計斜率小於2.0），那麼開始試驗前應考慮增加劑量級數因子超過按對數劑量計算的默認值0.5（即，級數因子為3.2）。同樣，對於已知斜率很陡的受試物，應選擇小於默認值的級數因子。
在決定是否及如何對下一隻動物給藥之前，每隻動物都應認真觀察48h。當滿足停止試驗標準之一時，停止給藥，同時根據終止時所有動物的狀態計算LD50估計值和可信區間。用最大可能性法計算LD50值。
當滿足下列停止試驗標準之一時，停止試驗：連續3隻動物存活；任意連續6隻實驗動物中有5隻連續發生存活/死亡轉換；第一隻動物發生轉換之後至少有4隻動物進入試驗，並且其LD50估算值的範圍超出臨界值（2.5倍）（首次轉換的第4隻動物之後，對每次給藥進行計算）。對於LD50和斜率的各種組合，在動物發生死亡/存活轉換之後，用4～6隻動物即可滿足停止試驗標準。但在一些情況下，化合物的劑量-反應曲線的斜率較小，可能另外還需要增加動物（總共可達15隻）。
（五）累積劑量設計法
在非齧齒類動物進行急性毒性試驗可采用累積劑量設計法。經典的試驗設計需要8隻動物，分對照組和給藥組，每組4隻動物，雌雄各2隻。
劑量的設計可以是1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg、300mg/kg、1000mg/kg、3000mg/kg，也可以采用10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg、320mg/kg、640mg/kg、1280mg/kg，通常隔日給予下一個高劑量，劑量逐漸加大，直到出現動物死亡時或達到劑量上限時為止。
當沒有動物死亡時，MLD（最小致死劑量）和LD50大於最高劑量或受限製劑量。當在某一劑量所有動物均出現死亡時，MLD和LD50應在最後2個劑量之間。當在某一劑量部分動物出現死亡，部分死亡出現在後繼的下一個高劑量，此時，MLD位於首次出現死亡的劑量和前一低劑量之間，LD50則應在首次出現動物死亡的劑量和所有動物均死亡的劑量之間。假如沒有動物死亡發生，常以最高劑量給予動物5～7天，以確定後續的重複給藥試驗中高劑量的選擇。
（六）半數致死量法
半數致死量法是一種經典的急性毒性試驗方法，試驗結果經統計學處理可獲得受試物的LD50.
第四節 長期毒性試驗中的動物實驗方法
長期毒性試驗（重複給藥毒性試驗）是指反複多次給藥予動物，觀察藥物對動物的毒性反應，一般指連續給藥14天以上。長期毒性試驗是藥物非臨床安全性評價的核心內容，是藥物從藥學研究進入臨床試驗的重要環節。長期毒性試驗的目的包括以下5個方麵：①預測受試物可能引起的臨床不良反應，包括不良反應的性質、程度、劑量——反應關係和時間——反應關係、可逆性等；②判斷受試物反複給藥的毒性靶器官或靶組織；③推測臨床試驗的起始劑量和重複用藥的安全劑量範圍；④提示臨床試驗中需重點監測的指標；⑤為臨床試驗中的解毒或解救措施提供參考。
一、動物實驗方法
1.受試物采用製備工藝穩定、符合臨床試驗用質量標準規定的樣品。受試物應注明名稱、來源、批號、含量（或規格）、保存條件及配製方法等，並附有研製單位的自檢報告。所用輔料、溶媒等應注明批號、規格和生產廠家，並符合試驗要求。
2.實驗動物采用2種實驗動物進行試驗，一種為齧齒類，另一種為非齧齒類。常選擇大鼠和Beagle犬或猴。動物年齡應盡量一致，一般大鼠為6～9周齡，Beagle犬為6～12月齡。每個試驗組使用相等數量的雌、雄動物，一般大鼠為雌、雄各10～30隻，Beagle犬或猴為雌、雄各3～6隻。
動物選擇正常、健康和未孕的動物，動物體重差異不超過平均體重的20%。動物應符合國家有關規定的等級要求，來源、品係、遺傳背景清楚，並具有實驗動物質量合格證。
3.給藥方案至少設高、中、低3個劑量給藥組、一個溶媒（或輔料）對照組，一個空白對照組和一個陽性對照組。給藥途徑應與臨床用藥途徑一致。原則上動物應每天給藥，給藥期限長（3個月或以上）的藥物每周至少給藥6天。
二、結果處理和分析
試驗前，齧齒類動物應進行至少5天的適應性觀察，非齧齒類動物至少應馴養觀察1～2周，非齧齒類動物還至少應進行2次體溫、心電圖、血液學和血液生化學指標等的檢測。
試驗期間，對動物進行外觀體征、行為活動、攝食量、體重、糞便性狀、給藥局部反應、血液學指標、血液生化學指標等的觀測。非齧齒類動物還應進行體溫、心電圖、眼科檢查和尿液分析。
給藥結束後，應對動物（除恢複期觀察動物）進行全麵的大體解剖，主要髒器應稱重並計算髒器係數。如發現有異常變化，應附有相應的組織病理學照片。非齧齒類動物對照組和各給藥組主要髒器組織均應進行組織病理學檢查；齧齒類動物對照組和高劑量給藥組動物，以及屍檢異常者應詳細檢查，如某一組織發生病理改變，其他劑量組動物該組織也應進行組織病理學檢查。
應在給藥結束後對部分動物進行恢複期觀察，以了解毒性反應的可逆程度和可能出現的延遲性毒性反應。長期毒性試驗必須檢測的指標如下。
1.應檢測的血液學指標紅細胞計數、血紅蛋白、血細胞比容、平均紅細胞容積、平均紅細胞血紅蛋白、平均紅細胞血紅蛋白濃度、網織紅細胞計數、白細胞計數及其分類、血小板計數、凝血酶原時間。
2.應檢測的血液生化學指標天門冬氨酸氨基轉換酶、丙氨酸氨基轉換酶、堿性磷酸酶、肌酸磷酸激酶、尿素氮、肌酐、總蛋白、白蛋白、血糖、總膽紅素、總膽固醇、甘油三酯、γ-穀氨酰轉移酶（非齧齒類動物）、鉀離子濃度、氯離子濃度、鈉離子濃度。
3.應檢測的尿液分析指標尿液外觀、比重、pH值、尿糖、尿蛋白、尿膽紅素、尿膽原、酮體、潛血、白細胞。
4.需稱重並計算髒器係數的器官腦、心髒、肝髒、腎髒、腎上腺、胸腺、脾髒、睾丸、附睾、卵巢、子宮、肺髒。
5.需進行組織病理學檢查的組織或器官腦（大腦、小腦、腦幹）、脊髓（頸、胸、腰段）、垂體、胸腺、甲狀腺、甲狀旁腺、食管、唾液腺、胃、小腸和大腸、肝髒、膽囊、腎髒、腎上腺、脾髒、胰腺、氣管、肺、主動脈、心髒、附睾、睾丸、卵巢、子宮、前列腺、乳腺、坐骨神經、膀胱、眼（眼科檢查發現異常時、視神經、給藥局部）骨髓、淋巴結（給藥局部淋巴結、腸係膜淋巴結）。注：為齧齒類動物可不進行組織病理學檢查的組織或器官。