第七節 致突變試驗中的動物實驗方法
一、鼠傷寒沙門菌營養缺陷型回複突變試驗
鼠傷寒沙門菌營養缺陷型回複突變試驗通常簡稱Ames試驗，是目前檢測基因突變最常用的方法之一。試驗用菌株為鼠傷寒沙門菌不同組氨酸缺陷型突變株，根據致突變物能靈敏而特異地使組氨酸缺陷型突變株回變成原型的特點，在缺乏組氨酸的培養基上，隻有少數自發回變菌落生長，而能誘發細菌回變的致突變物可使細菌生長增多，從而判斷受使物是否具有致突變性。
Ames試驗檢測誘變物的方法有平皿摻入法。預培養平皿摻入法及斑點試驗法等。平皿摻入法是Ames試驗最常用的標準方法。某些致突變物，如二甲基亞硝胺和二乙基亞硝胺等用平皿摻入法難以檢出時，可改用預培養平皿摻入法進行試驗，此法可使被檢物、S9混合液和細菌能在較高濃度下培養，故具有較好的檢測敏感性。
（一）試驗方法
1.平皿摻入法取融化並保溫在45℃的上層培養基一管，每管2ml，依次加入細菌培養液0.1ml，受試物溶液0.1ml，S9混合液或磷酸緩衝液（無需活化時）0.5ml，即在振蕩器上混合均勻，倒入底層培養基表麵，手握平皿，輕輕旋轉，使上層培養基及內含物均勻分布在底層培養基表麵。上述混合、傾倒及布勻操作應在20s內完成。平皿在室溫下放置幾分鍾後固化。然後將平皿平放桌麵上，並用黑紙遮蓋避光，注意平皿的水平放置，避免軟瓊脂厚度不均，形成表麵凸凹不平，影響計數結果的準確性。平皿在室溫下放置30～60min 後，將其翻轉放入37℃恒溫培養箱中。48h後取出平皿，計數每皿的回變菌落數。計算平皿上的菌落時，應觀察細菌背景的存在，沒有菌苔背景的平皿上出現的菌落不是回變菌落，不應計數。這類菌落是由存活下來的細菌，依靠頂層瓊脂內的少量組氨酸供養而形成。當被檢物為弱誘變劑或有抑菌作用的誘變劑時，可將培養時間延長至72h觀察計數菌落。
2.預培養平皿摻入法本法是在平皿摻入法的基礎上，事先將被檢物、S9混合液和細菌培養液在水浴中保溫一定時間後，然後倒入底層培養基鋪平培養即可。具體操作如下：取0.1ml被檢物溶液加入無菌試管中，再依次加入0.1ml測試菌株培養液、0.5ml S9混合液或0.5ml磷酸緩衝液，混勻後在37℃水浴中保溫20min，或30℃保溫30min，以中等速度振蕩培養，保溫結束後取出試管置冰水浴中。再加入2ml已融化的45℃頂層培養基，振動混勻並迅速傾倒在底層基本培養基上，其餘步驟與要求同平皿摻入法。
3.試驗劑量受試物最高劑量一般可為5mg/皿。至少有5個劑量組，最低劑量可為0.1～1.0μg/皿。
4.對照
（1）空白對照試驗中除基本試驗組分外，不外加任何物質，包括作為藥物溶解的水和溶劑等。
（2）溶媒對照以被試新藥的溶媒作對照，但不引發菌落回變數顯著增加。
（3）陽性對照分為間接和直接誘變劑對照，由於使用4種菌株的特性各異，因此使用的誘變劑又會有區別。應特別注意的是，使用間接誘變劑作陽性對照時，應同時設誘變劑不加S9混合物的對照並呈陰性結果，以表明該誘變劑僅在代謝活化條件下才具誘變性，從而也表明S9混合物的有效性。無論直接或間接誘變劑對照中誘發回變菌落數應較自發對照明顯增加。
（4）代謝活化（S9）對照是為了排除S9混合物自身對菌落回變可能的影響。
（二）結果的分析與判定
1.回複菌落數受試物所誘發的回複菌落數（x±s）增加，為自發對照的2倍或以上，並有劑量效應關係。
2.測試點某測試點（菌落數）為自發對照的2倍或以上，呈現可重複的並有統計學意義的增加。符合上述一條即可判為陽性。
3.菌株新藥的Ames試驗推薦使用4種菌株，當其中一株菌呈現肯定陽性變化時即可判定為陽性。試驗結果的統計方法以非參數檢驗較合適。
二、齧齒動物微核試驗
齧齒動物微核試驗是致突變試驗中唯一的一項體內試驗，是細胞培養染色體畸變試驗的一項補充與驗證。
（一）試驗準備
1.動物首選NIH小鼠，如無此種小鼠，可改用國內常用的其他品係小鼠。健康性成熟小鼠，體重20～24g。試驗全用雄性，每組至少6隻，若雌雄兼用，每組10隻，雌雄各半。
2.劑量至少3個劑量，最高劑量以1/2LD50為準，盡可能和臨床擬用途徑一致。
3.對照空白、溶劑和陽性對照組。一般一次給藥。
4.骨髓采集時間一般應選擇出現微核率陽性變化的最高點作為骨髓采樣時間點。若給藥後各時間點的微核率無顯著變化，則通常在給藥後24h處死動物采集骨髓。
（二）試驗方法
1.離心法
（1）動物處死用頸椎脫臼法處死小鼠，取一側股骨，剔除肌肉，用濾紙或紗布擦淨附著在股骨上的血汙與肌肉，剪去兩端股骨頭。
（2）取骨髓與離心用1～2ml注射器吸取少量小牛血清，將針尖插入骨髓腔中，推動注射器將骨髓衝入離心管（5ml體積）中，反複衝洗2～3次。用細長滴管吹打骨髓團塊，使其呈混懸狀態。以速度1000r/min離心7～10min，吸去上層液，用滴管將沉澱物吹打成混懸狀。
（3）製片吸取一滴混懸液，滴於潔淨載破片一端，以玻片推片將懸液推向載玻片另一端，注意推片的角度與壓力，使樣本上的細胞適度分散與形態良好。
（4）固定將玻片標本放置甲醇中固定5～15min，取出晾幹。亦可將玻片標本平置試驗工作台麵上，以滴管吸取甲醇液滴在玻片上，待甲醇液在玻片上將要揮發盡時，再補充滴加甲醇液，如此3～5次，晾幹。
2.直接法是指將小鼠骨髓直接擠壓塗布在玻片上，不必經過離心處理，此法更為簡便，是比較常用的方法。操作時，將股骨頭剪掉，用小型止血鉗夾緊一端，加壓將骨髓擠出，塗於事先加有一小滴小牛血清的玻片上，混勻後推片，晾幹並經甲醇固定即可。
（三）結果判定
微核的識別通常不太困難，在鏡下一般呈圓形或橢圓形，大小不盡相同，小者如針尖，大者可達細胞直徑的1/3～1/2.注意鑒別假微核，它們通常可由染料顆粒及血清的汙染等造成。必要時用熒光染色加以鑒別。
每隻動物的微核玻片標本在油鏡下計數1000個多染紅細胞（PCE）中的微核數，然後將每組動物的均值以千分率表示。
若給藥組試驗結果為陰性，則其微核率均值應在正常值範圍內；若試驗結果為陽性變化，則一般情況下各劑量組之間的變化應呈現劑量-效應關係，即隨劑量增高，效應強度也增高，且統計學處理與正常對照有顯著性差異，此種結果的陽性判斷可以成立；若試驗結果僅在某一劑量點出現陽性變化，且可以重複並有統計學意義，亦可判為陽性。
第八節 致癌試驗中的動物實驗方法
致癌試驗是人為地將受使物通過一定的方式與程序給予受試藥物，觀察在受試動物中腫瘤出現的頻率、類型、發生部位與時間等，並與對照物相比闡明受試藥物是否有致癌性。在此基礎上有條件地推論人類致癌的危險性。致癌試驗需要大量實驗動物，試驗周期長，耗費大，影響因素多。
一、動物實驗方法
1.動物選擇實驗動物的原則是：敏感、經濟、自發腫瘤率低、壽命不太長、抗病力強和易於管理等。優先采用的動物為大、小鼠。一般在斷奶後開始給藥。雌雄各半，動物品係多采用近交係的第一代雜交動物。
2.劑量與給藥時間和途徑一般設3個劑量組，還應設空白對照組、賦形劑對照組（必要時）。給藥時間大鼠為24個月，小鼠為18個月。給藥途徑原則上應與臨床擬用途徑一致。
3.動物飼養管理致癌試驗持續時間長，因此對試驗環境有嚴格的要求，必須符合國家標準。
4.觀察及檢查觀察受試動物的一般行為狀態的變化，包括外表、活動狀態和攝食等。定時稱量動物體重，注意有無腫瘤發生。對死亡的動物及時進行屍檢以查明原因。
病理學檢查是致癌試驗結果最重要依據。先對動物做外觀肉眼檢查，以發現有無肉眼可見的腫瘤，然後解剖動物進行內髒器官檢查及取樣本做病理組織學檢查。必要時，可考慮做血液學檢查。
二、結果評價
試驗結束時，計算受試動物的腫瘤發生率、腫瘤的發生時間、動物的平均壽命等，經統計分析處理做出正確的判斷。
第九節 刺激性、過敏性和溶血性試驗中的
動物實驗方法刺激性、過敏性和溶血性是指受試物製劑經眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、關節腔、皮膚、直腸、陰道、靜脈、動脈、肌內、皮下、靜脈旁和鞘內等非口服途徑給藥，對用藥局部產生的毒性（如刺激性和過敏性等）和（或）對全身產生的毒性（如過敏性和溶血性等）。
一、刺激性試驗中的動物實驗方法
刺激性是指非口服受試物製劑給藥後對給藥部位產生的可逆性炎症反應，目的是觀察動物的血管、肌肉、皮膚、黏膜等部位接觸受試物後是否引起紅腫、充血、滲出、變性或壞死等局部反應。
（一）皮膚刺激性試驗
1.實驗動物首選兔，也可選用小型豬。每組動物4～8隻，雌、雄各半。應設賦形劑對照，采用同體左右側自身對比法。試驗前24h對給藥區（通常在背部）進行脫毛處理（可剪、剃或用適宜的脫毛劑）。去毛範圍左、右各3cm×3cm，在用藥部位用砂紙磨或劃“#”字並以滲血為度。
2.給藥方法取受試物0.5ml直接塗布於一側已去毛的皮膚上，然後用2層紗布（2.5cm×2.5cm）和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定；另一側塗布賦形劑作對照。貼敷時間至少4h。貼敷結束後，除去受試物並用溫水或無刺激性溶劑清潔給藥部位。多次給藥皮膚刺激性試驗應連續在同一部位給藥，每次給藥時間相同，貼敷期限一般不超過4周。
3.結果觀察在自然光線或全光譜燈光下觀察皮膚反應。
（1）單次給藥皮膚刺激性試驗去除藥物後30～60min，24、48和72h，肉眼觀察並記錄塗敷部位有無紅斑和水腫等情況。如存在持久性損傷，延長觀察期限以評價上述變化的恢複情況和時間。但延長期一般不超過14天。對出現中度及以上皮膚刺激性的動物應在觀察期結束時對給藥局部進行組織病理學檢查。
（2）多次給藥皮膚刺激性試驗在每次去除藥物後1h以及再次貼敷前觀察及記錄紅斑及水腫、塗敷部位是否有色素沉著、出血點、皮膚粗糙或皮膚菲薄情況及其發生時間及消退時間。末次貼敷後，在去除藥物後30～60min，24、48和72h肉眼觀察並記錄塗敷部位有無紅斑和水腫等情況。其他同單次刺激試驗。