4）化學去核法利用某些化學試劑對卵母細胞進行處理，可準確去核。2000年，Baguisi 采用脫羰秋水仙堿處理小鼠卵母細胞可獲54%的去核率。1993年，Fulka等用依托泊苷（etoposide）和放線菌酮（cycloheximide，CHX）處理MI期小鼠卵子，使卵子的染色體相互緊密結合，不易分開。當排出第一極體時，次級卵母細胞的染色體隨極體一起排出達到去核目的。但此時，卵子內的MPF活性喪失，必須放入不含Etoposide和CHX的培養液中培養15h，恢複MPF活性。用秋水仙胺處理成熟的豬卵，質膜形成突起處即為凝集的染色體，將突起吸出，即能去核。此方法的囊胚率與對照相比無差別，並出生了核移植的小豬。
（4）供體核的導入將供體細胞核移入去核的卵母細胞，是克隆的重要步驟。隨著核移植技術的發展，已有多種移核的方法，且不同動物所使用的移核方法也有所不同。
1）融合法融合法是指利用電脈衝或化學方法使供體細胞膜與卵母細胞質膜接觸融合，以使供體核進入到受體卵母細胞胞質中。融合包括病毒融合、化學融合及電融合3類。病毒介導的融合：多種病毒可介導融合，其中較常用的是滅活的仙台病毒（HVJ）。將病毒顆粒附著在細胞膜上，使細胞戮著成堆，在37℃下，豁著部位的細胞膜被破壞，形成通道，細胞質融合在一起，完成細胞融合。化學融合：利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）可誘導細胞的融合。其原理是將待融合的細胞放入含PEG的溶液中處理，PEG可使細胞膜解聚，然後接觸部位的細胞膜融合，胞質彙合，使兩細胞得以融合。電融合：Willadson 等1986年在綿羊的克隆中首次引用了電融合的方法，現在已成為動物克隆中普遍采用的融合方法。其原理是在短時間強電場的作用下，細胞膜發生可逆性電擊穿，瞬時失去其高電阻和低通透特性，然後在數分鍾後恢複原狀。當可逆電擊穿發生在2個相鄰細胞的接觸區時，即可誘導他們的膜相互融合，從而導致細胞融合。現已發現，不同的動物所使用的融合液的成分，融合時的電壓參數會有所不同。改進融合液的成分，可提高融合率甚至胚胎發育率。在這方麵，不同的動物還需要不斷探索理想的融合條件。
2）胞質內注射法胞質內注射法是指直接將供體細胞核注射入去核卵母細胞中，不需經過融合。其優點是操作後得到的都是重構胚，而融合的方法一般不會達到100%的融合率。不足之處是對操作的技術要求較高或需要借助一定的設備。胞質內注射法最初是在小鼠的克隆中發展起來的。主要是借助一種稱為Piezo的壓電裝置完成的。Piezo可以在瞬間產生高的衝力，將細胞核送入胞質內，而不致造成卵子膜的破裂。利用這種方法已得到多批克隆小鼠。2000年，Onishi等利用這一方法得到了克隆豬。
（5）重構胚的活化在正常受精過程中，精子對卵子有一個激活的作用。激活主要是降低MII期卵母細胞中成熟促進因子（maturation-promoting factor，MPF）活性，使受精卵進入細胞周期，啟動胚胎發育。由於體細胞與精子不同，無激活卵母細胞的能力。因此，將供體核導入去核卵母細胞以後，要對重構卵進行激活，以啟動胚胎發育。常用的激活方法有：電刺激活化法和化學激活法。
1）電刺激活化法電刺激活化法主要是通過電流刺激，使卵母細胞膜的通透性發生變化，介導了細胞內外物質的運輸。其原理是在瞬間高壓電場的作用下，引起細胞膜發生瞬間的變化，使細胞膜瞬間形成很多微孔，溶液中的Ca2+離子通過微孔進入細胞質，使細胞內Ca2+離子呈脈衝式升高激活卵子。多次電刺激引起的Ca2+離子的多次脈衝式升高，可以模擬在自然條件下發生的受精過程。在哺乳動物體細胞核移植中，此法被廣泛地應用。
2）化學激活法化學激活法是利用化學激活劑對卵子進行激活的方法。能夠用於化學激活的化學試劑有Ca2+離子、三磷酸肌醇、乙醇、氯化鍶（SrCl2）、精子因子等。離子黴素-6-DMAP是目前為止牛羊核移植卵母細胞激活上應用效果最好的化學試劑。
（6）重構胚的培養與移植重構胚需一定時間的培養，方可移植到受體。家兔和豬重構胚在體外培養24h以內，就可通過非手術移植，而羊和牛所需培養時間較長，一般發育到囊胚或桑葚胚時移植。培養的方法主要有體外培養和體內培養2種方法。體內培養是將構建的重構胚用瓊脂包埋後移入綿羊或家兔輸卵管內。培養一定時間後，再用培養液衝輸卵管，得到發育到一定時期的胚胎，然後將胚胎移植到同期發情的受體中。但這種方法操作比較複雜，成本高，不利於商業性核移植。體外培養：體外培養是指將重構胚培養於人工配製的培養液中，在CO2箱中培養到一定時期再移植。這是目前大多數實驗室采用的培養方法。在體外進行重構胚培養時，選擇適當的培養液是非常重要的。重構胚的移植可根據受體動物的不同分為手術移植和非手術移植，對於2-細胞期到桑葚胚之前的胚胎多為手術輸卵管移植，而桑葚胚和囊胚多數采用非手術子宮移植。
（三）轉基因克隆技術
轉基因克隆技術是轉基因動物技術與克隆動物技術的有機結合，它是以動物體細胞為受體，將目的基因以DNA轉染的方式導入能進行傳代培養的動物體細胞，再以這些體細胞為核供體，進行動物克隆。將轉基因技術與動物克隆技術有機結合形成的轉基因克隆技術，在畜牧業上可使轉基因動物生產效率大為提高。通過轉染的方法先將目標基因導入家畜體細胞，再利用克隆技術使攜帶目標基因的家畜後代數目迅速擴增，所需動物數大幅度減少（比顯微注射法所需動物數減少一半），使少數優秀個體迅速擴大成群，並具有生產效率高、周期短、成本低等明顯優勢。同時，結合胚胎性別鑒定技術可生產出所期望性別的轉基因動物。英國羅斯林研究所宣布已成功克隆出3隻攜帶有人的基因、能高水平地表達人凝血因子IX（125μg/ml）的綿羊，展示了轉基因克隆動物技術的可能性。
三、動物克隆技術的應用
隨著生物技術的不斷發展和克隆技術的逐步完善，動物克隆技術已成為生物研究的新熱點。用該技術我們有希望實現物種大量繁殖、性狀改良以及珍稀動物的保護，實現生物反應器大量高效生產藥用蛋白，實現動物器官異種移植治療和挽救更多生命。
（一）物種改良和保護瀕危動物
將動物克隆與傳統的育種技術相結合，快速改善種群遺傳結構，大量培育高產低耗優質抗逆新品種。同時利用該技術和基因工程細胞工程等生物技術，保存和挽救瀕危動物，使得人類賴以生存的生態環境免遭破壞。眾所周知，大熊貓是我國的一種珍貴哺乳動物。由於環境及其自身生殖能力低下等原因，其種群數量日漸減少，被有關國際組織列為世界20大瀕危滅絕物種之一。我國的金絲猴、東北虎、揚子鱷現存數量也不多，均有希望通過動物克隆技術得到挽救和保護。另外，將來如能弄清細胞胚胎發育調控和死亡等基礎生物學問題，利用該技術就可以大量生產實驗動物模型並最大限度避免個體差異，使得醫學和獸醫學研究的實驗結果更加準確。
（二）生物醫藥方麵
通過轉基因技術和動物克隆技術相結合，將動物個體開發成為活體發酵罐，按照工程設計要求生產預期的藥物蛋白；目前利用轉基因克隆動物生產藥用蛋白主要有3種途徑：一是通過血液，例如將人的血紅蛋白基因轉入豬細胞，通過轉基因豬來生產人血紅蛋白。二是通過尿腺在轉基因小鼠的尿液中表達出人的生長激素；三是通過乳腺，泌乳是動物的基本生理功能，而且乳腺能大量泌乳，對重組蛋白質進行翻譯後加工、糖基化等，所以乳腺是目前公認的生產重組蛋白較理想的動物器官。1991年，有人將人α1抗胰蛋白酶基因導入綿羊體內，得到了帶有該基因的轉基因綿羊。轉基因綿羊能以泌乳的方式生產人α1抗胰蛋白酶，產量達每升35g，於是，轉基因綿羊就變成了一個能生產藥物的活工廠。1997年底，英國Roslin研究所和PPL公司通過克隆轉基因體細胞，獲得了6隻整合neo或neo和F-Ⅸ基因綿羊，這標誌著核移植介導的轉基因技術成功問世。2000年，英國PPL公司將人AAT基因定點整合到胎仔成纖維細胞的α1原纖維（procollagen）基因座位，而後用轉基因細胞進行核移植，生產出世界首例基因打靶綿羊，其中AAT蛋白含量達到了650mg/L，遠高於顯微注射法的18mg/L的水平。2004年，台灣培育出帶有血友病的“第 Ⅷ 凝血因子”的體細胞克隆羊，這隻克隆羊在2005年產下一隻帶有同樣的“第 Ⅷ 凝血因子”的公羊。
（三）醫學方麵
人類細胞係的克隆，可產生單克隆抗體，用來診斷和研究疾病。利用無性繁殖技術，還可培育出為人類器官移植提供來源的特殊動物品種。據報道全世界每18min就會增加一個等待器官移植的新病人，但是人供體器官嚴重缺乏，科學家研究發現動物器官的異種移植才是最有效的解決途徑。由於豬器官與人的器官在大小功能上比較接近，豬作為人類器官移植的供體動物研究較多，很早就有醫生使用豬的心髒瓣膜凝結因子、胰島細胞，甚至腦細胞治療人類疾病。然而目前異種器官移植還存在超急性排斥反應和PERV感染2個問題。針對以上問題，科學家已經找到引起超排斥反應的基因-1，3半乳糖基轉移酶基因，並通過競爭和抑製該基因表達，以及從供核細胞中剔除該基因來阻止超急性排斥反應的發生。我國在“治療性克隆”研究領域獲得重大突破，“治療性克隆”課題被列為國家級重點基礎研究項目。此課題分為上、中、下遊3塊，上海市轉基因研究中心成國祥博士負責上遊研究，上海第二醫科大學盛惠珍教授和曹誼林教授分別主持中、下遊的研究工作。其整體目標是，將病人的體細胞核移植到去核的卵母細胞內，經過一定的處理使其發育到囊胚，再利用囊胚建立胚胎幹細胞，在體外誘導分化成特定的組織或器官，如皮膚、軟骨、心髒、肝髒、腎髒、膀胱等，再將這些組織或器官移植到病人身上。利用這種方法，將從根本上解決同種異體器官移植過程中最難的免疫排斥反應，同時還使得組織或器官有了良好的、充分的來源。目前，由上海市轉基因研究中心負責的上遊研究工作，即把病人的體細胞移到去核的卵母細胞，並經一係列的處理發育至囊胚取得成功。
（四）牧業方麵
選育遺傳性狀穩定的良種家畜，不僅省時省力，還可加快繁殖速度。
1.用於優良品種的保持如荷蘭奶牛年產奶5000kg，最高可達26000kg；法國夏洛萊（Charolasis）牛每頭可產600～700kg優質牛肉；澳洲的美麗奴細毛羊（australian merino）年剪毛量為8kg以上，是高級毛料製品的原料。大約克豬6個月體重可達105kg。家禽中我國的絲毛烏骨雞、北京油雞，具有特殊風味與藥用價值。育成一個新品種需要很長時期，牛為15年，羊、豬為10年，雞為8年。就地克隆，就等於就地育種與良種繁殖。
2.培育遺傳均一的實驗動物（近交係）克隆技術為近交係實驗動物培育提供了新途徑。通過這一途徑培育的實驗動物，遺傳組成完全一致，並且比用傳統的近親繁殖方法更省時，品係更純。在實驗研究中，克隆動物比普通近交係動物的應用更優。
（五）培育各種疾病動物模型
利用動物克隆技術可以培育基因完全一致的實驗動物模型，為遺傳學、病理學研究提供良好的實驗材料。
第四節 基因敲除動物
基因敲除（gene knock-out），又稱基因打靶（gene targeting），是通過一定的途徑使目的基因失活或缺失的技術。通常意義上的基因敲除是指通過外源DNA 與染色體DNA 之間的同源重組，精細地定點修飾和改造基因DNA 片段的技術。
20世紀80年代初，小鼠胚胎幹細胞的分離和體外培養的成功為基因敲除奠定了技術基礎。1985年，哺乳動物細胞中同源重組的存在得到首次證實，這又為基因敲除奠定了理論基礎。2年以後，Smithies和Capecchi等2個研究小組同時報道在小鼠胚胎幹細胞中進行了基因敲除。1989年，Thompson 等通過基於胚胎幹細胞囊胚注射的基因敲除，建立了次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因（hrpt）被定點剔除的小鼠模型，隨後又產生了許多小鼠基因敲除動物模型。