（二）細胞核移植
細胞核移植技術是目前成功的進行無性繁殖的技術。它的基本原理是將一個細胞核用顯微注射的方法放進另一個細胞裏去。前者為供體，可以是胚胎的幹細胞核，也可以是體細胞的核。受體大多是動物的卵子。因卵子的體積較大，操作容易，而且通過發育，可以把特征表現出來，因此細胞核移植技術，主要是用來研究胚胎發育過程中，細胞核和細胞質的功能，以及二者間的相互關係，探討有關遺傳，發育和細胞分化等方麵的一些基本理論問題。該技術已有幾十年的曆史。1952年，Briggs和King在兩棲類動物中首次獲得核移植成功，使得發育生物學上的幾個根本問題得到了解答。Gurdon用非洲爪蟾的上皮細胞等體細胞的核做移植，確立了已經分化的細胞核可以正常發育的事實。我國胚胎學家童第周先生等在魚類細胞核移植方麵做了許多工作。他們在1976年首次獲得的鯉鯽移核魚，不僅有理論意義，而且也為魚類育種開辟了一條新的途徑。
哺乳動物的細胞核移植也早已引起關注，因哺乳類受精卵極小，體外培養和細胞核移植技術難度大，因此直到1981年lllmensee和Hoppe才首次報道獲得成功。Mcgrath和Solter在1983年發表了用核移植技術與細胞融合相配合的方法，能將90%以上的移核卵培養到胚泡期。經過胚胎移植，均可獲得一定比例的核移植小鼠。
1.胚胎細胞核移植用顯微注射的方法分離尚未著床的早期胚胎細胞（分裂球），將其單個細胞導入去除細胞核的未受精的成熟的卵母細胞，經過點融合，將該卵母細胞胞質和導入的胚胎細胞核融合、分裂、發育成胚胎。把該胚胎移植給受體，繼而妊娠產仔。1986年，Willadsen將8和16細胞期綿羊胚胎的卵裂球與去核卵母細胞融合，再移植到結紮母羊的輸卵管中，獲得了3隻克隆羊羔。1987年，Tsunoda等將4和8細胞胚的細胞核移入2細胞去核胚，產生了克隆鼠。從此以後，世界上相繼獲得了克隆綿羊、克隆牛、克隆兔、克隆猴等。1996年，我國首批克隆小鼠在湖南醫科大學誕生。該校盧光秀教授指導研究生用胚胎細胞核移植方法克隆L5黑毛小鼠。實驗如下：①從昆明小鼠輸卵管中取出成熟卵母細胞，去其細胞核；②從L5黑毛小鼠2～8細胞胚中取單個卵裂球，將其細胞核移入昆明鼠去核卵母細胞；③將移核後的胚胎移植到昆明鼠輸卵管中，孕育20天，實驗獲得6隻L5黑毛克隆小鼠。
2.體細胞核移植1997年2月27日，英國愛丁堡羅斯林（Roslin）研究所的伊恩·維爾莫特科學研究小組向世界宣布，世界上第一頭克隆綿羊“多利”（Dolly）誕生，這一消息立刻轟動了全世界。“多莉”的產生與3隻母羊有關。一隻是懷孕3個月的芬蘭多塞特母綿羊，2隻是蘇格蘭黑麵母綿羊。芬蘭多塞特母綿羊提供了全套遺傳信息，即提供了細胞核（稱之為供體）；一隻蘇格蘭黑麵母綿羊提供無細胞核的卵細胞，另一隻蘇格蘭黑麵母綿羊提供羊胚胎的發育環境——子宮，是“多莉”羊的“生”母。其整個克隆過程簡述如下：從芬蘭多塞特母綿羊的乳腺中取出乳腺細胞，將其放入低濃度的營養培養液中，細胞逐漸停止了分裂，此細胞稱之為供體細胞；給一頭蘇格蘭黑麵母綿羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵細胞，並立即將其細胞核除去，留下一個無核的卵細胞，此細胞稱之為受體細胞；利用電脈衝的方法，使供體細胞和受體細胞發生融合，最後形成了融合細胞，由於電脈衝還可以產生類似於自然受精過程中的一係列反應，使融合細胞也能像受精卵一樣進行細胞分裂、分化，從而形成胚胎細胞；將胚胎細胞轉移到另一隻蘇格蘭黑麵母綿羊的子宮內，胚胎細胞進一步分化和發育，最後形成一隻小綿羊。出生的“多莉”小綿羊與多塞特母綿羊具有完全相同的外貌。
一年以後，另一組科學家報道了將小鼠卵丘細胞（圍繞在卵母細胞外周的高度分化細胞）的細胞核移植到去除了細胞核的卵母細胞中，得到20多隻發育完全的小鼠。在克隆小鼠中，卵丘細胞是經如下過程得到的：通過連續幾次注射絨毛膜促性腺激素，使雌鼠誘導成高產卵量狀態，然後從雌鼠輸卵管中收集卵丘細胞與卵母細胞的複合體，經透明質酸處理使卵丘細胞散開。選擇直徑為10～12μm的卵丘細胞用做細胞核供體（前期實驗表明，若用直徑更小或更大的卵丘細胞的細胞核，經過細胞核移植的卵母細胞很少發育到8細胞期）。所選擇的卵丘細胞保持在一定的溶液環境中，在3h內進行細胞核移植（與此不同的是，在獲得“多利”時用做細胞核供體的乳腺細胞先在培養液中傳代了3～6次）。卵母細胞（一般處於減數分裂中期II）通過與上麵描述類似的方法，從不同種的雌鼠中收集。在顯微鏡下小心地用直徑大約7μm的細管取出卵母細胞的細胞核，盡量不取出細胞質。同樣小心取出卵丘細胞的細胞核，也盡量去除所帶的細胞質（通過使取出的細胞核在玻璃管中往複運動數次，以去除所帶的少量的細胞質）。在細胞核被取出後5min 之內，直接注射到已經去除了細胞核的卵母細胞中。進行了細胞核移植的卵母細胞先放在一種特製的溶液中1～6h，然後加入二價的鍶離子（Sr2+）和細胞分裂抑素B。前者使卵母細胞激活，後者抑製極體的形成和染色體的排除。再取出處理過的卵母細胞，放在沒有鍶和細胞分裂抑素B的特製的溶液中使細胞分裂形成胚胎。不同階段的胚胎（從2細胞期到胚泡期）被分別植入幾天前與已經結紮雄鼠交配過的假孕母鼠的輸卵管或子宮中發育。發育完全的胎仔鼠在大約19天後通過手術取出。
較胚胎克隆而言，體細胞克隆有著重要的生物學意義。胚胎細胞是一個沒有分化的細胞，如受精卵變成2細胞、4細胞、8細胞等，甚至到囊胚裏邊的內細胞團細胞。到原腸胚以後，它們將分成三胚層，即外胚層、中胚層、內胚層。外胚層就演化成為皮膚等，內胚層就演化成為消化道上皮等，中胚層演化成骨骼、肌肉和結締組織，這些組織的細胞為分化的細胞。胚胎細胞是沒有分化的，克隆比較容易。體細胞是高度分化的，可是現在就用這樣的體細胞來克隆照樣也能夠恢複全能性，恢複到胚胎細胞具有的功能。就是在卵子裏麵有一些去分化因子，能夠使進去的高度分化的體細胞核去分化、重新程序化變成一個與胚胎細胞一樣的全能性的細胞。所以它能繼續發育分化成2細胞、4細胞和8細胞。與正常的胚胎發育一樣，發育成囊胚，然後移植到受體子宮裏去。所以體細胞克隆的意義就在於它是生物學的基礎理論上的一場革命，因為高度分化的細胞的很多基因是關閉的，現在放到卵子裏能夠獲得全能性，也就是說基因被重新打開了。
3.幹細胞核移植幹細胞是人體內最原始的細胞，它具有較強的再生能力，在幹細胞因子和多種白細胞介素的聯合作用下可擴增出各類的細胞。在1999年末的年度世界十大科技成果評選中，“幹細胞研究的新發現”榮登榜首。幹細胞研究有不可估量的醫學價值。分離、保存並在體外人工大量培養使之成長為各種組織和器官，成為幹細胞研究的首要課題。目前，幹細胞的分離和培養技術獲得了重大進展，利用單克隆免疫吸附能識別細胞類型或細胞譜係的表麵抗原，其分離純度和細胞活力都很高。1999年以色列魏茨曼科學院將白介素-6與幹細胞內的受體分子合並研製出一種新分子，可使幹細胞在維持原本特性的基礎上進行自我增殖且細胞壽命也有所延長。在臨床運用中，造血幹細胞應用較早。在20世紀50年代，臨床上就開始應用骨髓移植來治療血液係統疾病。到80年代，外周血幹細胞移植技術逐漸推廣。美國Stmlells Csliifornia公司用血液幹細胞在小鼠體內培育出成熟的肝細胞。目前幹細胞主要指胚胎幹細胞，它可以從早期胚胎胚泡的內細胞團或桑葚胚的原始生殖細胞中分離獲得。研究證實，分離的小鼠胚胎幹細胞在體外可以分化形成包括心肌細胞、造血幹細胞和神經纖維細胞在內的各種細胞；將胚胎幹細胞重新移入小鼠胚泡，可以參與形成嵌合體胚胎。說明胚胎幹細胞具有發育的全能性。另外還發現，胚胎幹細胞體外培養壽命比胎仔細胞和成體細胞要長。因此，胚胎幹細胞是克隆哺乳動物供核細胞的最佳來源。有人利用胚胎幹細胞克隆小鼠已經獲得成功。1999年，Vogel將胚胎幹細胞植入不能發育成個體的四倍體胚胎中，再將胚胎植入小鼠子宮中，獲得了完全由胚胎幹細胞發育來的克隆小鼠。我國於1995年分離出小鼠胚胎幹細胞，並有嵌合體小鼠產生。
4.核移植法克隆哺乳動物的操作程序核移植技術經過多年的發展，已建立了一整套的程序，包括：供體細胞的準備、卵母細胞的采集、核的移植、重構胚的活化、重構胚的體外培養、移植等。對於不同的動物，程序中的某個環節的方法可能會有所不同；而同一物種，對程序中某一環節的改進有可能會提高實驗效率。
（1）供體細胞的準備細胞核供體來源可以是胚胎卵裂球、胎仔成纖維細胞、乳腺細胞等。現在對幹細胞的研究發現，幹細胞（胚胎幹細胞）可作為一種良好的細胞核供體。供體細胞所處細胞周期是影響克隆胚胎發育的關鍵因素，在體細胞克隆研究中使用的供體細胞主要還是自然停滯GO/G1期的細胞、血清饑餓控製的GO期細胞以及高度彙合生長發生接觸抑製的細胞（此時的細胞絕大部分處於GO/G1期）。供體細胞的獲得主要有2種方式：新鮮製備和體外培養。新鮮製備主要指采用剛從組織上分離不久，不經過體外培養的細胞直接用於核移植。體外培養獲得供體細胞，主要是取所要克隆的某一組織的細胞，在體外進行原代及傳代培養，得到貼壁細胞。於核移植前，用胰蛋白酶消化貼壁細胞，得到懸浮細胞，用於核移植。目前的動物克隆多數采用體外培養的細胞。
（2）核移植受體細胞的準備過去曾用去核受精卵和去核2細胞胚為細胞質受體，現在多用去核卵母細胞。卵母細胞去核可用化學處理和紫外光滅活染色體的辦法，但以顯微手術法簡便有效。通常借助顯微操作儀，將成熟卵母細胞的極體及其下方的少量細胞質（包括卵母細胞中期染色體）吸出。卵母細胞的來源，多采用由卵巢排出或從輸卵管回收MII期成熟卵母細胞。
（3）去核去核是指將受體卵母細胞的遺傳物質去除，以接受外源的供體細胞核。完全去除受體卵母細胞的核遺傳物質是進行哺乳動物克隆的前提。常用的去核方法有以下幾種。
1）盲去法由於在普通光鏡下無法直接觀察到中期紡錘體和染色體，一般是根據第一極體的位置來確定MII期卵母細胞中染色體的位置，進行去核操作，即利用剛排除第一極體的卵母細胞，其紡錘體與第一極體還未完全分開或剛分開，此時第一極體的位置指示了紡錘體的位置。若用注射針吸取第一極體及其下方的1/4～1/3細胞質（含中期染色體），即可將卵母細胞核吸出。也可用固定針固定卵母細胞，使第一極體處於時鍾12點的位置，用一根直徑1～2μm的細針從第一極體刺穿透明帶後將卵母細胞挑離固定針並在固定針下緣來回摩擦，使透明帶破開一個小口，然後重新固定卵母細胞令破口處於時鍾12點的位置，用一平口針在3點鍾的位置擠壓卵母細胞，將第一極體連同下方的胞質（含中期染色體）一起擠出。盲去法的優勢是方便、快捷，可以降低體外操作的時間。但由於第一極體並非總是與卵母細胞內的染色體對位，隨著培養時間延長，兩者位置發生偏移，極體可在卵周隙中移動位置，不能準確指示核的位置，從而使去核率不能達到100%。
2）DNA熒光染料顯示法用一種染料來顯示卵子內的遺傳物質無疑是一種最準確的去核方法。目前已有多種染料用於輔助去核。常用Hoechst染色去核法：有A、B、C三種方法。A法：使用含5～10μg/ml Hoechst33342的操作液在紫外光照射下，DNA顯示藍色，這樣就可按常規操作除去中期卵母細胞的染色質，操作時間不應超過15s，以免傷害卵母細胞而影響重構胚的發育。同時在操作時應避免紫外光照射別的供體及卵母細胞。該法的優點是去核準確，效率較高，但要求技術熟練。B法：注射針在吸取第一極體及部分胞質後退出，紫外光下檢查針管中是否有染色質。C法：用吸管除去連同極體在內的一半卵母細胞的胞質，並使其完整保留。然後打開紫外燈檢查，收集無核的一半細胞用做受體。
3）蔗糖顯示法Wang等在研究中發現，小鼠卵母細胞經含0.09M蔗糖的顯微操作液室溫處理10min後，在普通光鏡下即可觀察到卵母細胞邊緣有突起，該突起之下即是與周圍胞質明顯不同的MII期紡錘體，吸取這部分胞質，檢測發現去核率達100%。Liu等在牛的核移植實驗中，對此方法做了修改。將蔗糖濃度升高到0.3M時，卵母細胞的紡錘體也形成透明突起，去核率達95%，且吸取的胞質很少。與對照相比，這種去核方法得到的重構胚的分裂率、囊胚率和囊胚細胞數均無差異，說明這是一種安全的去核方法。