20多年以來，在胚胎幹細胞技術和同源重組（homologous recombination）技術基礎上發展起來的基因敲除技術得到了蓬勃的發展。而且，隨著基因敲除技術的發展，新的原理和技術也被運用到基因敲除中來，比較成功的主要有基因的插入突變和iRNA。但是，利用基因的同源重組原理進行基因敲除仍然是目前建立基因敲除動物模型普遍使用的方法。
一、利用同源重組進行基因敲除
（一）基因敲除的技術程序
基於同源重組的基因敲除技術程序基本包括：構建打靶載體；將靶載體導入小鼠胚胎幹細胞中，使載體上的同源DNA 片段與胚胎幹細胞中的相應部位發生同源重組；篩選出發生了定點基因敲除的胚胎幹細胞；將篩選出的胚胎幹細胞注入小鼠的囊胚，將囊胚導入假孕母鼠子宮；將得到的嵌合體進一步雜交，獲得含外源基因的純合子，即建成基因敲除動物模型。
1.打靶載體的構建打靶載體通常都包含有兩段與打靶目標位點兩端同源的區域，中間一段不同源且為目的序列，並帶有某種藥物篩選標記（如neo 基因）。根據載體與靶基因組同源序列雙鏈斷裂位點的位置不同，打靶載體分為插入型載體和置換型載體2種類型。其中，以置換型載體較為常用。
=2.胚胎幹細胞的獲得目前基因敲除常用的胚胎幹細胞是小鼠品係129，其他如兔、豬、雞的胚胎幹細胞也有使用。
3.同源重組將打靶載體導入胚胎幹細胞中，使其與胚胎幹細胞內的同源序列發生同源重組。常用的導入方法有電穿孔法、顯微注射法等。其中顯微注射法應用最廣，命中率高，但是技術難度較大；電穿孔法的命中率較低，但是便於操作。
4.同源重組陽性細胞的篩選基因敲除中同源重組陽性細胞的篩選多采用正負篩選策略（positive and negative selection，PNS）。在一個置換型基因打靶載體中，正向選擇基因neo插入載體的目的片段中，負選擇基因HSV-tk（human semian virus-thymidine kinase）置於目的片段的外側。neo 基因有雙重作用，一方麵形成靶位基因的插入突變，同時作為正向篩選的標記；HSV-tk基因是負選擇基因，含有HSV-tk的重組細胞對丙氧鳥苷（Ganciclovir，GANC）敏感，在GANC 培養基中不能存活。其他還有多種篩選方法，如PCR 篩選法、poly-A 缺失篩選、啟動子缺失篩選等。
5.胚胎幹細胞胚胎嵌合體的產生基因敲除產生胚胎幹細胞胚胎嵌合體的傳統方法是通過顯微操作係統將胚胎幹細胞注射入處於囊胚期的胚胎中，但是這種方法需要熟練的技術和昂貴的設備。近年來，人們通過將8細胞期的胚胎和胚胎幹細胞聚集在一起的方法也得到了胚胎幹細胞胚胎嵌合體。這種方法無需特殊設備，隻需要有基本的胚胎操作技巧即可。
6.表型研究與基因敲除純合體動物的獲得一般可通過觀察得到的嵌合體動物的生物學性狀的改變而達到研究基因功能的目的。但是，因為同源重組常發生在一對染色體中的一條染色體上，所以常需進行2代以上的遺傳才能得到遺傳穩定的基因敲除的純合體動物。
（二）常用的基因敲除策略
1.完全基因敲除敲除中常用的策略之一是利用PNS 載體，借助正向選擇標記通常插入靶基因中最重要的外顯子中，或者通過同源重組刪除靶基因最重要的功能域，實現完全的基因敲除（complete knock-out）。無論是插入型載體還是置換型載體，在發生同源重組時都有可能將打靶載體上正向選擇標記基因和外源DNA 片段同時導入染色體。
為了解決基因打靶後外源標記基因的殘留問題，20世紀90年代又發展出了2種新的打靶策略。
一種是所謂的“打了就走”（hit and run）策略，又稱為進退策略，由Reid 等於1991年提出。其主要特點是一個打靶載體，發生2次重組（一次雙交換，一次染色體內重組）。第一步用插入型載體進行同源重組，第二步利用藥物抗性基因篩選陽性細胞。這一策略的缺點是篩選時間長，染色體內重組無法精確控製，結果可能得到無突變的原始基因；而且無法同時引進多個位點突變。
另一種是標記和置換（tag and exchange）法，由Askew 等於1993年提出，其特點是2個打靶載體，2次重組，對同一位點進行多次突變時可節省時間。第一步同源重組時正負選擇標記插入，對靶基因進行標記；第2步打靶用同源序列上帶有精細突變的載體來轉染第一步得到的胚胎幹細胞克隆，帶有精細突變的同源序列將置換下被“標記”的靶基因。這一策略的缺點是二次打靶操作困難，長時間的體外操作可能會影響胚胎幹細胞發育成生殖細胞的能力。這2種策略的共同特點是基因打靶之後無外源標記基因殘留。
2.條件性基因敲除條件性基因敲除實際上是在常規的基因敲除的基礎上，利用重組酶Cre 介導的位點特異性重組技術，將對某一基因的修飾限定於某一特定類型的細胞或者某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。
Cre-Loxp 係統由Hua Gu 和JD Marth 等人於1993年提出，這一係統包括Cre 重組酶和loxP 位點兩部分。前者由來自E。coli 噬菌體P1的cre基因編碼，loxP 由2個13bp 的反向重複順序和8bp 的間隔區域構成。Cre 重組酶可介導34bp 的重複單元，切除同向重複的2個loxP 位點間的DNA 片段和一個loxP 位點，保留一個loxP 位點。除了Cre-Loxp 係統外，酵母中的FLP-frt 係統和R 重組酶係統具有與之相似的功能。
進行條件性基因敲除時，首先要構建靶基因2側排列有同向loxP 位點的打靶載體，經與胚胎幹細胞進行同源重組，篩選並得到表型與野生型一樣的小鼠。這種小鼠雖然帶有位於2個同向loxP 位點之間的靶基因，但靶基因並未發生其他變化。同時構建Cre 轉基因小鼠。當這2種小鼠雜交時，便可得到同時帶有位於2個同向loxP 位點之間的靶基因和Cre 基因的子代。結果Cre 重組酶就會介導靶基因兩側的1oxP 間發生切除反應。因此，隻要控製Cre 表達特異性和表達水平就可實現對小鼠中靶基因修飾的特異性和程度。
條件性基因敲除可用於研究基因在特定組織細胞或個體發育特定階段的功能，尤其對於完全敲除具有致死效應的基因來說，條件性基因敲除對於其功能的研究具有重要意義。
3.誘導性基因敲除誘導性基因敲除是指利用控製Cre 表達的啟動子的活性或所表達的Cre 酶活性具有可誘導的特點，通過對誘導劑給予時間的控製或利用Cre 基因定位表達係統中載體的宿主細胞特異性和將該表達係統轉移到動物體內的過程在時間上的可控性，從而在loxP 動物的一定發育階段和一定組織細胞中實現對特定基因進行遺傳修飾之目的。采用這種基因敲除技術，可以人為地控製誘導基因突變的時間；可以避免因基因突變而產生死胎的問題；如用病毒或配體/DNA複合物等基因轉移係統來介導Cre的表達，則可省去建立攜帶Cre的轉基因動物的過程。
根據所用誘導劑的種類，誘導性基因打靶可分為四環素誘導型、幹擾素誘導型和激素誘導型等幾種類型。其中，前二者所用誘導劑為控製Cre 基因表達的啟動子活性的活化物，而後者所用誘導劑為Cre 酶活性的激活物。
二、利用隨機插入突變進行基因敲除——基因捕獲
1.基因捕獲（gene trapping）的原理基因捕獲是一種新型的利用隨機插入突變進行基因敲除的方法。其原理是利用某些能隨機插入基因序列的病毒、細菌等載體，在目標基因組中進行隨機插入，建立一個攜帶隨機插入突變的胚胎幹細胞庫。常見的基因捕獲載體包含一個無啟動子的報道基因，例如neo 基因。如果neo 基因隨機插入到胚胎幹細胞的染色體組中，並利用捕獲基因的轉錄調控元件實現表達，這種胚胎幹細胞就可以從含G418選擇培養基中篩選出來。最後，可以通過篩選標記基因側翼cDNA或染色體組序列分析來獲得捕獲基因的信息。
2.基因捕獲的優缺點常規的基因打靶方法，必須針對靶位點在染色體組文庫中篩選相關的染色體組克隆，繪製相應的物理圖譜，構建特異性的基因敲除載體並篩選中靶胚胎幹細胞，這需要耗費大量的人力和時間。要想獲得一個基因敲除動物純合體，通常需要1年以上時間。
采用基因捕獲法，可以節約大量的工作和費用，更快速地進行基因功能的分析。但是這種方法隻能敲除在胚胎幹細胞中表達的基因，而且無法對基因進行精細的遺傳修飾。
三、利用RNAi進行基因敲除
1.RNAi基因敲除的原理RNAi現象是由康奈爾大學的Su Guo 博士於1995年在用反義RNA阻斷線蟲基因表達時發現的。當雙鏈RNA進入細胞後，在Dicer 的作用下被裂解成siRNA；同時，在RdRP（RNA-directed RNA polymerase）作用下自身擴增後，再被Dicer酶裂解成siRNA。隨後，siRNA的雙鏈解開變成單鏈，並和某些蛋白形成複合物。此複合物同siRNA的互補mRNA結合，一方麵使mRNA 被RNA 酶裂解；另一方麵以siRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA 互補鏈。結果mRNA 變成了雙鏈RNA，它在Dicer 的作用下也被裂解成siRNA。這些新生成的siRNA 具有誘發RNAi 作用，通過這個聚合酶鏈式反應，細胞內的siRNA大大增加，顯著增加了對基因表達的抑製。
2.RNAi基因敲除的特點與同源重組法相比，RNAi基因敲除更為簡便，大大縮短了實驗周期。對於一些敲除後小鼠在胚胎時就會死亡的基因，可以在體外培養的細胞中進行RNAi基因敲除以研究它的功能。RNAi 還能高效特異的阻斷基因的表達，因此也是研究信號轉導通路的良好工具。
四、基因敲除的應用
基因敲除技術在生命科學中具有重大的應用價值。
1.建立人類疾病模型目前已經建立的基因敲除鼠模型已有近千種，並以每年數百種的速度增加著，其中以各種疾病相關基因的敲除模型為主，內容涉及腫瘤、心血管疾病、糖尿病和肥胖症、血液病、生殖障礙、免疫係統疾病等諸多方麵。這些疾病動物模型對於研究人類各種疾病，尤其是遺傳病的發病機製、疾病的診斷、預防以及基因治療等有著重大意義。例如，Donehower 和他的同事們首次得到了敲除P53基因的小鼠。研究結果證明，缺失正常的P53基因使鼠有產生多種腫瘤的傾向，說明P53是一種腫瘤抑製基因。
2.器官移植基因敲除技術有望解決人類器官移植的兩大難題：器官來源與排斥反應。英國PPL公司采用基因敲除技術，敲除了豬的α-1，3-半乳糖苷轉移酶基因，希望采用豬的器官用於異種器官移植，突破器官來源受限的難題而又不會引發免疫排斥反應。α-1，3-半乳糖苷轉移酶抗原決定簇位於豬的細胞膜表麵，是抑製異種器官移植的重要障礙。在缺乏這種酶的情況下，超急性排斥反應即不會再發生。雖然還有許多問題需要解決，但使人類看到了希望。
3.轉基因動物研究基因敲除使人們定點、定量地改變哺乳動物基因組結構的夢想成為現實，而且，與傳統的轉基因技術相比，基因打靶技術所要求的動物數量大大減少。另外，顯微注射生產的轉基因動物因為存在隨機整合，容易引起染色體沉默效應而抑製轉基因的表達。基因敲除是在特定位點引入單拷貝突變，可以克服這種負效應。
伴隨著體細胞克隆技術的發展，轉基因動物的研究也將得到新的發展。例如，現已產生了一種小鼠，它的主要免疫球蛋白（Ig）基因家族已被缺失，相應地用人Ig家族的輕鏈、重鏈替代，而後用單克隆抗體技術大量生產以小鼠免疫係統生產的完全人體化抗體。
基因敲除還可用於研究基因結構與功能關係、藥物依賴性研究、動物育種等方麵。
在基因敲除技術的應用過程中，我們應該意識到：基因敲除不單純是一種滅活基因的技術，還是有目的地改變基因活性的一種手段。