第二節 轉基因動物
一、轉基因動物的發展現狀及應用前景
眾所周知，21世紀將是生命科學的世紀，有人預測：轉基因動物+生物反應器+克隆技術，將在下世紀的國民經濟中占重要地位。
轉基因動物技術是用實驗的方法將外源基因導入動物組織細胞的基因組內而改變動物遺傳性狀的技術。在轉基因動物製備過程中，可表達的目的基因前加上乳蛋白啟動子，轉基因動物的乳腺就成為一個生物發生器，目的基因的產物可以從動物的乳汁提取。目前已有的轉基因產品，如人凝血因子、尿激酶、白介素、幹擾素等。應用轉基因動物加生物反應器來生產醫用多肽或蛋白其效率遠遠高於傳統的遺傳工程。
克隆動物技術是將動物卵細胞的遺傳物質吸出，將高度分化的體細胞的核注入到受體卵球細胞內，經過融合、去極化形成全能細胞，發育成動物個體的單性生殖技術。
這幾項技術聯合起來將給世界經濟帶來不可估量的效益。
轉基因動物技術是在動物整體水平研究目的基因的生物技術，它的特點可以用“分子及細胞水平操作，組織及整體水平表達”這樣一句話來概括。它的意義在於克服了動物種間的生殖隔離狀態，實現了遺傳物質的交換和重組，為我們進行生命科學研究提供了新手段，擴大了新視野。
轉基因動物發展的曆史雖然不長，1980年，Gordon等人首先報道了用顯微注射純化DNA的方法，獲得了轉基因小鼠。在此後的一年時間內，有6個實驗室陸續報道通過向原核期的小鼠胚胎顯微注射DNA，獲得了轉基因小鼠。但是，在這些早期的實驗中，使用的基因結構未曾認真地設計和構建，大多是使用容易得到的材料進行實驗，實驗結果僅僅表明使用DNA顯微注射的方法可以將外源基因導入小鼠種係之中。至於被導入的基因有何生理作用，則不能夠檢測出來。真正發生重大影響的是1982年Brinster和Palmiter合作生產的超級小白鼠。它們建立了MT啟動子驅動大鼠GH基因編碼序列的基因表達結構。實驗結果證明，含有外源GH基因的小鼠長得比正常小鼠幾乎大一倍。此結果引起整個生物學界的轟動。到目前為止，已建立起來的轉基因動物有轉基因小鼠、大鼠，雞、兔、魚、豬、羊、牛等。主要用於基因的表達調控研究、人類疾病的轉基因模型、基因治療、動物品種的改良及基因產品的製備。總之，轉基因動物研究已經成為當前生物高科技研究的熱點，它不僅為人們研究生命科學提供了更有效的工具，而且隨著轉基因動物技術的發展，轉基因產品將滲透到醫療、農產品、畜產品、食品中，人們在日常生活中就能感受到它的無處不在。
二、轉基因動物的概念和基本原理
轉基因動物（transgenic animal）是指染色體基因組中整合有外源基因並能遺傳給後代的一類動物。整合到動物染色體基因組的外源基因被稱為轉基因（transgene）。
當製備轉基因動物時，外源基因可能隻整合到動物的部分組織細胞的基因組中，也可能整合到動物的所有組織細胞的基因組中，我們把隻有部分組織細胞中整合有外源基因的動物稱嵌合體動物（chimera）。
逆轉錄病毒感染法、胚胎幹細胞介導法製備的動物第一代均為嵌合體。
嵌合體動物和轉基因動物的相同點是它們染色體基因組內都整合有外源基因。不同點：轉基因動物所有組織細胞基因組中均整合有外源基因，嵌合體隻是部分組織細胞內；轉基因動物能將外源基因遺傳給子代，嵌合體隻有當外源基因整合入生殖細胞時才能遺傳；外源基因的整合發生在第一次卵裂以前則動物所有組織細胞中都整合有外源基因，若發生在第一次卵裂後則得到嵌合體動物。
轉基因動物的基本原理是將改建後的目的基因（或基因組片段）用顯微注射等方法注入實驗動物的受精卵（fertilized eggs）（或著床前胚胎細胞），然後將此受精卵（或著床前胚胎細胞）再植入受體動物的輸卵管（oviduct）（子宮）中，使其發育成攜帶有外源基因（foreign gene）的轉基因動物，人們可以通過分析轉基因和轉基因動物表型的關係，從而揭示外源基因的功能，也可以通過轉入目的基因培育品種優良的工程動物。
三、轉基因動物的構建
（一）外源基因（foreign gene）的製備
製備轉基因動物首先要有目的基因，它可以是：預先分離的某一基因；逆轉錄法得到的cDNA；人工合成的DNA片段；含有目的基因的供體細胞基因組DNA。
通常將擬導入的目的基因在載體質粒上製成克隆，然後轉化至大腸杆菌，擴增質粒；分離純化重組質粒，用適當的限製性內切酶消化，製備成線狀基因片段，最後將線狀或環狀重組DNA分別溶入無菌生理鹽水，濃度為50～100μg/ml，-20℃儲存備用。
目的基因直接導入受體細胞，往往不能表達或表達能力較差，必須經過改建。一般來說成為轉基因的外源基因至少應包括兩部分，即調控元件（regulatory element）和結構基因（structural gene）。有時為了檢測方便還需要加上一個報告序列（report sequence）
（二）實驗動物（laboratory animal）的準備
1.供體動物轉基因研究中提供受精卵的雌性動物，一般有種係要求，若無遺傳背景的特殊要求可選用F1動物。以小鼠為例：可選用4～6周齡的雌鼠用PMS和HCG做超排卵處理，注射間隔42～48h，第二次注射後讓雌鼠與正常雄種鼠合籠，次日選有陰道栓的雌鼠，處死後立即取出輸卵管，在解剖鏡下衝出受精卵。超排好的小鼠每次能衝取20～30個卵。
2.與卵供體動物交配的正常雄性動物選擇與卵供體動物同種係的繁殖力較強的雄性個體。以小鼠為例，6～8周齡性成熟，使用8～10個月需更換種鼠。
3.雄性不育動物輸精管結紮的雄性，具有正常的交配能力，但精液中無精子，和雌性交配後，雌性呈假孕狀態。以小鼠為例：選擇性成熟的雄鼠實施雙側輸精管結紮術，2～3周後經檢驗能使雌鼠懷孕但不產仔者。
4.受體動物接受轉基因後的受精卵或早期胚胎，使之在體內發育、分娩的雌性動物。
以小鼠為例：選6周到5個月齡的雌性個體與不育雄鼠交配（與卵供體動物同步），選擇有陰道栓的動物用於卵或胚胎移植。
四、基因導入技術
轉基因動物技術目前常用的方法主要有顯微注射技術、胚胎幹細胞技術、逆轉錄病毒載體技術、精子載體技術和YAC法等。
（一）顯微注射法
哺乳動物個體是從最原始的受精卵發育而來，采用顯微注射儀直接將外源基因導入受精卵，再移植到受體動物，使其發育成轉基因動物，稱為顯微注射法。顯微注射儀主要包括一個倒置顯微鏡和微操縱臂。輸卵管固定受精卵，注射器吸取外源DNA注入受精卵的雄前核內。這種方法由於基因整合多發生在卵裂之前，較少產生嵌合體，有利於對當代轉基因的表達分析，並能快速建立轉基因品係。這是目前製備轉基因動物應用最多、最有效的方法。當外源基因的整合發生在受精卵第一次分裂之後則產生嵌合體動物（20%）。
1.優點①外源基因在宿主染色體上的整合率相對較高；②以此種方法導入外源基因時，無須載體；③60%～80%的轉基因子代鼠中，外源基因分布在所有的組織和細胞中；④導入的外源基因可長達50kb。
2.缺點①外源基因的整合是隨機的，整合率不能控製；②有些動物的原核看不清楚，如豬、山羊等，須經特殊處理，才能有效導入；③需要較精密的儀器，費用昂貴。
（二）逆轉錄病毒載體法
逆轉錄病毒的cDNA具有能整合到宿主細胞染色體內的特點，以逆轉錄病毒為載體，通過轉染的方式實現外源基因的轉移稱逆轉錄病毒感染法。這種方法操作簡單，不需要顯微操作儀。但逆轉錄病毒載體的構建較複雜，容納外源基因的量有限，獲得的第一代動物均為嵌合體動物，而且病毒載體序列可能幹擾目的基因的表達。
1.優點轉基因效率高，單位點、單拷貝整合，易分析插入位點，鳥類的卵在產出後已發育到桑葚胚期，不可能進行顯微注射，而逆轉錄病毒載體對多細胞胚的轉化十分方便，因此在培養轉基因禽類研究中應用很廣泛。
2.缺點隨機整合，攜帶外源DNA片段大小受限，一般小於10kb，易產生嵌合體（mosaic），實驗周期長；有安全隱患，有可能因DNA重組產生活病毒。
（三）胚胎幹細胞介導法
哺乳動物囊胚期的內細胞團含有一些未分化的細胞，這些具有發育全能性的細胞在體外培養建株後稱為胚胎幹細胞（embryonic stem cell 簡稱ESC或ES細胞），用重組的逆轉錄病毒作載體感染ES細胞，再將此ES細胞移植入受體動物的囊胚腔內，可產生嵌合體動物，如果轉化的ES細胞參與生殖細胞的建立，就可以進一步建立轉基因動物。這種轉基因方法稱為胚胎幹細胞介導法。它產生的第一代動物全部是嵌合體動物。
優點：ES細胞可進行體外培養，對ES細胞的遺傳操作就變得相對簡單。
目前ES細胞的建立和應用隻在小鼠取得了成功，其他僅有一些報道。
（四）精子載體法
將外源DNA與精子一起孵育，精子可捕獲外源DNA，並通過受精過程將外源DNA導入受精卵的方法稱為精子載體法。優點是成本低。缺點是結果不穩定，目前方法體係還未完全建立。
有人曾將兔的精子與氚標記的SV40病毒DNA共培養，結果在精子頭部檢測到放射性，這些精子受精後在2細胞期仍具放射性，證實精子具有捕獲外源DNA的能力，並通過受精過程導入了受精卵。1989年Lavitrano等人報道，用此法建了轉基因鼠，立即引起各國科學家的興趣，這種方法如果可行，通過人工授精的途徑來製備轉基因大家畜（受精卵不透明）將大大降低成本。隨後有8個研究小組用同樣的方法製備了1300隻小鼠無一攜帶外源DNA，因此這種方法還沒有被廣泛接受，但仍有不少人在進行這方麵的嚐試，處在完善和發展階段。
（五）YAC法
利用酵母人工染色體（YAC）作為載體製作轉基因動物的方法。酵母人工染色體（YAC）載體是近年來發展起來的新型載體，能克隆百萬對堿基的大片段DNA。
優點：保證了大片段DNA的完整性，提高了較長外源片段在轉基因動物研究中的整合率，保證了目的基因上下遊的側翼序列的完整性，因而可以消除或減弱基因整合後的位置效應。
因此YAC介導法製備轉基因動物具有廣闊的應用前景。
除上述幾種常用的轉基因方法外，人們為了適應於一些特殊需要也探索了一些其他的方法。例如誘變技術（P265）等，這些方法都不太成熟，其應用也正被人們驗證。幾種基因導入方法的比較參。
原核注射精子載體核移植逆轉錄病毒基因準備易易中等難基因大小中等無限製無限製小定點整合有可能不可能有可能不可能技術要求高低高低胚胎存活中等中等低高陽性率1%～10%20%100%約100%
五、胚胎的移植
胚胎移植是將導入外源基因的受精卵（胚胎）移植到受體動物的輸卵管或子宮中，使其正常發育、分娩，得到攜帶外源基因的親本個體。以小鼠為例，注射有外源基因的單細胞至桑葚胚期的卵移植到假孕0.5天的雌鼠輸卵管內，輸卵管移植要求卵有透明帶包裹。注射後3.5天的囊胚移植到假孕2.5天的雌鼠子宮內，子宮移植不需透明帶。
上述方法轉移未注射卵，其中50%～75%可發育成胎鼠，而轉移注射過的卵發育成胎鼠的占10%～30%。所以最好給每隻假孕雌鼠轉移20～30個已注射卵，每胎可產5～7個仔。
六、轉基因動物的鑒定
假孕動物經過受精卵或胚胎移植後，精心飼養、分娩後取動物組織（尾尖、耳尖），提取基因組DNA，用點雜交、Southern雜交和PCR等方法（確定轉基因是否整合以及整合的拷貝數等）來鑒別目的鼠的基因組DNA中是否含有外源基因。還可以用染色體原位雜交技術檢測整合的位點。通過鑒定確定首建轉基因動物，再經過子代檢測建立轉基因種係。