第19章 基因工程動物(一)(3 / 3)

(一)胚胎幹細胞的生物學特性

胚胎幹細胞結構與早期胚胎細胞相似,胞體體積小,核大,胞漿少,有1~2個核仁。胚胎幹細胞呈克隆狀生長,細胞緊密地聚集在一起,形似鳥巢,細胞間界限不清。胚胎幹細胞的核型是正常的,它保留了整倍體的性質。但不同物種的胚胎幹細胞的結構特征又有所不同。如小鼠胚胎幹細胞形成的細胞集落一般呈緊密的球形,不易被常規消化方法分散成單細胞;而人及某些靈長類動物的胚胎幹細胞形成的細胞集落相對比較扁平、鬆散,很容易被胰蛋白酶消化成單細胞。

胚胎幹細胞在體外需要在滋養層細胞上培養才能維持其未分化狀態,一旦脫離滋養層,就自發地進行分化。由於胚胎幹細胞具有分化為各種類型組織細胞的潛能和具備正常的二倍體核型,所以與正常桑葚胚聚集或注射到囊胚腔時,它能夠參與胚胎發育形成嵌合體,參與嵌合體多種組織、器官的發育。

胚胎幹細胞具有培養細胞的所有特征,如可在體外培養、增殖、操作和凍存,凍存後的細胞可以在需要的時候複蘇,繼續培養而不失其原有的特征。

(二)胚胎幹細胞的分離、培養

1.胚胎幹細胞的分離目前常用的穩定的胚胎幹細胞係是小鼠品係129.小鼠胚胎幹細胞一般取自2.5天的桑葚胚(morula)或3.5天的早期胚泡(blastocyst),而人類的胚胎幹細胞則多取自7天的胚泡。桑葚胚細胞的分離相對容易,而囊胚階段的細胞已經開始了最初的分化,分離要複雜一些。在囊胚腔的一端是內細胞團,外側是扁平的滋養層細胞。體外分離胚胎幹細胞時,要將滋養層細胞剝離去除,取內細胞團細胞進行培養,常用的方法是免疫外科法。免疫外科法的原理是先將胚泡與兔抗小鼠的血清共同孵育一段時間後,加入補體,使外層的滋養層細胞發生溶解,而內細胞團細胞則不受影響。動物的物種、品係、受孕狀態等很多因素,都會影響胚胎幹細胞的分離。

此外,胚胎幹細胞還可以通過克隆技術獲得,即所謂的“治療性克隆”。將小鼠的體細胞核轉移到未受精的去核卵母細胞中,經鍶激活使其發生卵裂形成胚泡,然後從中分離篩選胚胎幹細胞。

2.胚胎幹細胞的培養早在1970年,Martin 和Evans已從小鼠中分離出胚胎幹細胞並在體外進行培養。1998年,Wisconsin大學的James Thomson和Johns Hopkins大學的John Gearhart從人囊胚的內層細胞團中取得胚胎幹細胞。他們把胚胎幹細胞與小鼠的骨髓間質細胞進行了共培養。結果表明胚胎幹細胞可以進行長達5個月的非分化增殖,同時還保持著分化為滋養層組織及3種胚層組織的能力。

在胚胎幹細胞研究過程中,相繼發現了幾種分化抑製因子,如LIF(白血病細胞抑製因子)、DIA(分化抑製因子)、HILDA(人白細胞介素),並證明了它們在體外同樣具有抑製胚胎幹細胞分化的作用。胚胎幹細胞常規培養液主要由LIF、胎牛血清、L-穀氨酸、非必需氨基酸、丙酮酸鹽、乙醇、穀氨酰胺以及高濃度的含各種氨基酸和葡萄糖的一種培養基(DMEM)組成。其中,值得注意的是胎牛血清的濃度及其質量是影響胚胎幹細胞生長狀況的重要因素。

依據細胞分化抑製因子的來源不同,胚胎幹細胞的培養體係分為兩大類。一類為有滋養層培養體係,滋養層細胞通過接觸機製和非接觸機製促進胚胎幹細胞增殖並阻止其分化。目前采用的滋養層有3種:STO(一種已建係的小鼠胚胎成纖維細胞)、MEF(小鼠原代胚胎成纖維細胞)、HEF(同源胚胎成纖維細胞)。另一類為無滋養層培養體係,需要直接在培養液中加入外源性的細胞分化抑製因子LIF。這種方法可以避開利用滋養層細胞培養胚胎幹細胞的繁瑣操作,排除實驗中的細胞接觸抑製作用及滋養細胞分泌其他因子的幹擾,並避免了處理滋養層細胞時所用絲裂黴素對胚胎幹細胞的毒性作用。因此,采用無滋養層培養體係是胚胎幹細胞體外培養的趨勢。

胚胎幹細胞的體外培養應在嚴格的無菌條件下進行,所用的器皿和試劑都必須保證無菌而且要徹底清除去垢劑。

(三)胚胎幹細胞的體外分化

胚胎幹細胞的體外定向分化是胚胎幹細胞研究的重要內容。從理論上講,胚胎幹細胞可分化為體內任何類型的細胞。所謂定向分化,是指在適宜條件下,胚胎幹細胞能夠分化為某一特定類型的細胞。研究發現,在培養體係中撤去成纖維細胞滋養層,胚胎幹細胞經數天的培養,便分化形成胚體(embryo bodies),胚體中有來自外胚層的神經細胞、上皮細胞,來自中胚層的造血細胞、橫紋肌細胞、平滑肌細胞、心肌細胞、軟骨細胞、內皮細胞和來自內胚層的胰島細胞。同樣,如果培養體係中不添加LIF,胚胎幹細胞也會發生分化。目前已經報道,小鼠胚胎幹細胞在體外可定向分化為神經元、神經膠質細胞、星型膠質細胞、胰島細胞、脂肪細胞、心肌細胞、橫紋肌細胞、平滑肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、內皮細胞、角質形成細胞及各類血細胞等。

目前研究胚胎幹細胞定向分化的常用策略有3種。第一種策略是改變細胞的培養條件,這是研究胚胎幹細胞定向分化的基本策略,常用的方法有3種,一是與輔助細胞共培養。當胚胎幹細胞與其他細胞一起進行培養時,隨著細胞種類的不同,它將向不同方向分化。例如,PA6是一種骨髓細胞起源的基質細胞係,當小鼠胚胎幹細胞與PA6細胞一起培養時,胚胎幹細胞將向神經係統分化。二是在半固體培養基中原位生長分化。例如,將小鼠胚胎幹細胞接種在膠原表麵,將有利於它分化成內皮細胞。三是向培養基中添加生長因子及化學誘導劑等。目前常用於胚胎幹細胞定向分化的生長因子有表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等,常用的化學誘導劑主要是維甲酸(retinoic acid)、二甲基亞碸(DMSO)。例如,在維甲酸和雙酪基環磷酸腺苷的共同作用下,胚胎幹細胞可分化為血管平滑肌細胞;將小鼠胚胎幹細胞置於僅含bFGF的培養基中增殖,然後加入PDGF,得到表達神經膠質前體標誌分子的多能祖細胞,當除去bFGF和PDGF後,這些細胞最終向少突神經膠質細胞或星型膠質細胞分化。

第二種策略是將外源性基因導入胚胎幹細胞,使其分化為某一特定類型的細胞。若把在特定發育階段中起決定作用的基因導入胚胎幹細胞的基因組中,將會使胚胎幹細胞準確分化為某一特定類型的細胞。目前已有報道使用這種方法可使胚胎幹細胞定向分化為神經細胞、肌肉細胞、胰腺細胞等。

第三種策略是體內定向分化。將胚胎幹細胞移植到動物體的不同部位,不同微環境將使胚胎幹細胞多數分化為該組織特異性的細胞。如Deacon等將小鼠胚胎幹細胞直接移植到帕金森病模型大鼠的紋狀體中,這些細胞多數分化為TH+的多巴胺能神經元及5-TH+的5-羥色胺能神經元,這些神經元的軸突可以延伸到宿主的紋狀體內,為受損神經元提供有功能的神經支配。

(四)胚胎幹細胞的應用

胚胎幹細胞的高度自我更新能力和發育的全能性使其成為很多生物醫學基礎領域的重要研究工具。

胚胎幹細胞將是我們了解胚胎發育機製的重要研究手段,可用於研究人類發育生物學,建立新的人類疾病動物模型和細胞培養模型。通過胚胎幹細胞基因打靶途徑建立轉基因動物模型是目前最常用的轉基因動物製備方法,該方法將重組子的篩選工作從傳統的動物個體篩選提前到了胚胎幹細胞水平,簡化了實驗步驟,加快了實驗過程。研究人員可以應用基於胚胎幹細胞與基因打靶技術的複雜轉基因體係將一些在發育過程中非必需的特定基因敲除,在體內進行功能缺失研究,或是使特定基因在體內發育瞬間表達,來研究基因在胚胎不同發育時期中的作用。因此,胚胎幹細胞也是進行基因功能研究的一個有效手段。另外,像阿爾茨海默病等一些神經退行性疾病的動物模型隻能代表該類疾病在人類身上的部分過程,因此通過胚胎幹細胞來建立體外模型具有非常重要的意義。

胚胎幹細胞最激動人心的潛在應用是用來修複甚至替換喪失功能的組織和器官,因為它具有發育分化為所有類型組織細胞的能力,可為細胞替代治療提供用之不竭的來源。“治療性克隆”研究已獲得多數科學家和政府的支持。任何涉及喪失正常細胞的疾病都有望通過移植由胚胎幹細胞分化而來的特異組織細胞來進行治療,而且可以避免移植過程中引起的免疫排斥問題,還能彌補當今器官移植所麵臨的供體匱乏的不足。胚胎幹細胞還可應用於基因治療,矯正缺陷基因。

胚胎幹細胞還可以用來生產克隆動物。通過細胞核移植技術將胚胎幹細胞核移植到去核卵母細胞中,再在假孕受體子宮發育成動物個體,與重組DNA技術結合,可以快速改良和培育實驗動物品種。

另外,胚胎幹細胞體外培養定向誘導分化體係的建立對發育生物學中細胞分化的研究具有重要意義。

同時,腫瘤細胞的生長繁殖與幹細胞之間有許多驚人的相似之處,基於此的幹細胞學說,為探索腫瘤的發生機製和腫瘤的預防治療提出了新的思路和方向。

但是,胚胎幹細胞技術還不夠成熟,隻在小鼠獲得了穩定的胚胎幹細胞係。同時還有許多問題,如胚胎幹細胞向不同組織細胞“定向分化”的條件、胚胎幹細胞如何才能在體外發育成完整的器官等,都還有待進一步研究以尋求技術與理論上的突破。

(五)成體幹細胞

在成年動物體內,正常的生理代謝或病理損傷也會引起組織或者器官的修複、再生,這一過程就是成體幹細胞進一步分化的結果。與胚胎幹細胞相比,源於成體組織的成體幹細胞由於完全是自身遺傳背景,避免了倫理問題和免疫屏障,同時來源豐富、容易獲得、體外誘導條件相對成熟,在血液病、心腦血管疾病、惡性腫瘤等疾病的治療和組織損傷修複方麵有廣闊的應用前景,已成為生命科學研究的一個新熱點。

1.成體幹細胞與胚胎幹細胞的異同成體幹細胞與胚胎幹細胞一樣,都可在體外進行自我更新,並且在適宜的條件下,均可分化成為具有特殊形態和特定功能的子代細胞,但是二者之間又有著許多不同之處。

成體幹細胞和胚胎幹細胞的來源不同。目前胚胎幹細胞多取自胚胎或流產胎仔,在倫理道德方麵存在著相當大的爭議;成體幹細胞多來自成體的各種組織,不存在倫理道德上的壓力。

成體幹細胞的分離純化相對較胚胎幹細胞困難得多。這是因為胚胎幹細胞的起源非常清楚,多來自囊胚的內細胞團或胎仔的生殖脊,因此胚胎幹細胞的分離純化比較容易;而成體幹細胞在成體組織中數量很少,而且人們還沒有找到其特有的細胞表麵標誌,要對其進行分離純化比較困難。

成體幹細胞與胚胎幹細胞的另一個不同之處在於分化潛能和體外增殖能力。胚胎幹細胞可在體外無限增殖,而成體幹細胞的增殖能力則較有限。此外,胚胎幹細胞可分化為體內任何一種細胞,而成體幹細胞的分化潛能相對有限。

2.成體幹細胞的來源成體幹細胞主要有以下幾個來源。

(1)胚胎細胞由胚胎幹細胞定向分化,或移植分化而成。

(2)胚胎組織由分離胚胎的組織、細胞分離或培養而成。

(3)成體組織由臍血、骨髓、外周血、骨髓間質、脂肪細胞等得到。

造血幹細胞是最早發現、研究最多和最先用於治療疾病的成體幹細胞。近年來,隨著幹細胞研究的不斷深入,幾乎在所有組織中都發現了幹細胞,如骨髓、腦、血管、骨骼肌、肝、胰、皮膚、胃腸道的上皮、脂肪等。

3.成體幹細胞的橫向分化成體幹細胞已經有相當程度的分化,如果不受外加條件的影響,一種組織的成體幹細胞傾向於分化成該組織的各種細胞,比如造血幹細胞在體內自動分化成各種血細胞。1999年12月美國科學家Margarel Goodell等人分離出小鼠的肌肉幹細胞,體外培養5天後,與少量的骨髓間質細胞一起移植入接受致死量輻射的小鼠中,結果發現小鼠肌肉組織幹細胞可以“橫向分化”(trans-differentiation)成血液細胞。世界各地的科學家隨後證實,在特定的外加條件下,一種組織的成體幹細胞可以“橫向分化”成其他組織的功能細胞。例如,造血幹細胞可以分化成神經細胞和肝細胞;間充質幹細胞可以分化成神經、肌肉、軟骨和骨等多種細胞。

成體幹細胞“橫向分化”能力的發現是幹細胞研究中的一個裏程碑,為成體幹細胞的應用開辟了更為廣闊的前景。但是成體幹細胞“橫向分化”的機製還在研究之中,不能盲目得出具有“橫向分化”能力的成體幹細胞可取代或超過胚胎幹細胞應用價值的結論,應對其進行更嚴格的實驗檢驗。