（2）影響顯微受精的因素在實際操作過程中，顯微受精可受到多種因素的影響，主要有注射部位、精子狀態、精子發生階段、卵母細胞狀態、顯微操作環境條件等。
注射部位或注射方式的選擇是由實驗動物卵母細胞的耐操作能力確定的。大量實驗表明，鼠類尤其是小鼠卵母細胞進行胞質內注射十分困難，所以多采用帶下注射法，受精率可達到67.3%，其中54%的受精卵可發育成個體。在人類，這2種技術都十分有效。在顯微受精操作中，應根據精子類型和動物種類來選擇合適的注射部位，以達到滿意效果。
精子的狀態，如精子是否獲能、頂體反應與否以及精子的新鮮程度、完整程度等都將直接影響顯微受精的結果。有研究者曾用獲能時間不同、頂體完整和頂體反應的精子進行透明帶帶下注射，結果顯示獲能0.5h、2h和6h精子的受精率沒有顯著差異，而頂體完整和頂體反應後的精子未能使卵母細胞受精。與未獲能精子相比，獲能精子具有更強的原核形成和發育能力。在進行透明帶帶下注射時，常采用獲能精子。進行胞質內注射時，精子是否獲能和頂體反應與否並不重要。另外，精子的死活對於胞質內注射也不是十分重要，精子核對於低溫和高溫都有很強的耐受性。
超數排卵的方法也是影響顯微受精結果的因素之一，因為它將直接影響卵母細胞的成熟度，而高質量的卵母細胞正是顯微受精成功的前提。另外，顯微注射操作人員的操作技能、操作工具的質量以及操作時的環境條件都會影響顯微受精的結果。
（四）胚胎培養（embryo culture）
早期胚胎的培養是胚胎工程中的重要技術環節。目前體內培養係統主要有兔輸卵管、羊輸卵管、離體小鼠輸卵管培養係統（IMOS）、雞胚培養係統等。體內培養係統的研究和發展使人們了解了更多的有利於胚胎發育的因子，而且為獲得高質量的胚胎提供了方便而高效的工具。體外胚胎培養是指在人工創造的類似於體內條件的環境中，對獲取的早期胚胎進行體外培養，以便觀察其發育或人工幹預某一發育過程的技術。早在20世紀80年代中期，人們就對小鼠胚胎體外培養的理論與培養方法都進行了廣泛而深入地研究。
1.體外胚胎培養的方法目前體外胚胎培養一般有2種方法。一種是共培養係統，這種係統首先要求在培養皿上貼壁培養輸卵管上皮細胞、顆粒細胞等，然後將受精卵和貼壁培養的上皮細胞一起培養，直至生產出可用胚胎。另一種是簡單化學限定培養法。相對而言，簡單化學限定培養法使用方便、培養液配製簡單，而且成分明確便於研究特定物質對胚胎發育的影響，因此在早期胚胎體外培養中得到廣泛使用。
2.影響胚胎培養的因素胚胎培養過程中，有多種因素可能會影響到動物胚胎的正常發育，例如，動物品種、培養液成分、培養環境條件、培養方法等。
1989年，有研究者采用相同培養液培養不同品係小鼠1細胞期胚胎時發現，不同品係小鼠胚胎在同一培養液中囊胚發育率差異很大。這是因為不同品係小鼠的早期胚胎代謝類型並不完全相同，相應決定了對培養液的成分和濃度的要求也是不同的，因此對不同品係小鼠胚胎應采用與之發育相適應的高效、簡單培養液。
培養液的成分主要有葡萄糖、氨基酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、鹽類等。在進行小鼠胚胎體外培養的研究中，研究者發現培養液中的葡萄糖在8細胞期以前是引起胚胎發育阻滯的主要原因之一，在8細胞期以後又是胚胎發育的主要能源物質。所以在對小鼠胚胎體外培養時，應根據小鼠胚胎不同發育階段代謝特點合理增減葡萄糖以獲得較好的胚胎體外發育效果。氨基酸是體外培養胚胎發育的不可缺少的重要營養物質，主要作為蛋白質合成必備物質，同時還作為能量物質、一些重要物質合成前體以及有效的滲透保護劑等，在胚胎體外培養中發揮著重要作用。許多研究表明，必需氨基酸和非必需氨基酸都對附植前胚胎體外發育有促進作用。非必需氨基酸主要作用在胚胎分裂期，必需氨基酸作用時期相對較長，尤其是8細胞以後階段。EDTA在培養液中的作用主要是螯合一些有害於胚胎發育的重金屬離子。同時，EDTA和穀氨酰胺能夠協同作用，替代葡萄糖成分，促進體外培養胚胎的發育。但這種協同作用的機製還需要進一步的深入研究。鹽類也是培養液的基礎物質，具有維持培養液正常滲透壓、pH值的作用。大多數胚胎培養液采用NaHCO3/CO2緩衝係統以維持生理性的pH值（7.2～7.4）。使用這種緩衝係統時要注意，當培養液放置在空氣中時，pH值將升高，導致胚胎損傷甚至死亡。可作為替代的另一種緩衝體係為磷酸鹽緩衝體係。體外操作時一般使用HEPES緩衝體係。
在胚胎體外培養過程中，溫度、氣相環境、滲透壓、培養液中過氧化氫濃度以及培養液體積與培養胚胎數之間的比例等都是影響胚胎體外發育的重要因素。
培養方法也是影響胚胎體外發育的因素之一，胚胎培養研究早期常用試管法，後來的微滴覆蓋法（Brinster法）具有更多優勢，如減少培養液體積、便於定期換液等。
胚胎培養是胚胎移植技術體係中的一項重要內容，一般可應用於以下幾種情況：未成熟卵子可經體外培養成熟，以進行體外受精；受精卵經培養成為卵裂球以後，用於胚胎移植或者冷凍保存；冷凍胚胎解凍後，經過培養再進行胚胎移植，可提高移植成活率；導入外源基因的受精卵培養到卵裂球後再實施胚胎移植，也可以提高成功率。另外，通過胚胎培養的實驗研究，有助於逐步揭示胚胎細胞的新陳代謝、發育生長等生命活動的奧秘。
（五）胚胎保存（embryo preservation）
胚胎的保存可根據實際情況分為短期臨時保存和長期冷凍保存。短期臨時保存是指將暫時不使用的胚胎在37℃培養液中保存，或者在活體動物的輸卵管內保存1～2天。長期冷凍保存胚胎是指應用超低溫冷凍技術將胚胎保存起來而不喪失活力。1971年，Whittingham首次報道冷凍小鼠胚胎獲得成功。隨後，對大鼠、兔胚胎的冷凍保存也取得了成功。到目前為止，已有十多種哺乳動物胚胎冷凍獲得成功。
1974年，在國際專題討論會上首次提出了運用冷凍胚胎技術保存小鼠遺傳資源的主張。1980年，國際實驗動物科學委員會舉行了實驗動物冷凍儲存專題討論會。據統計，國際上已有20餘個國家，數十個單位開展了小鼠冷凍胚胎庫的工作。其中，最著名的是美國傑克遜實驗室、英國醫學研究中心（MRC）、美國國立衛生研究院（NIH）。我國在這方麵也取得了一定發展，現已建立了國家齧齒類實驗動物種子中心及齧齒類實驗動物冷凍胚胎庫。
目前已研究出多種冷凍保存實驗動物胚胎的方法，主要有使用冷凍儀的常規冷凍法和快速玻璃化冷凍法等。其主要技術環節包括抗凍保護劑的選擇與添加、植冰和降溫、胚胎解凍、抗凍保護劑的去除等步驟。
1.常規冷凍法一般使用冷凍儀按照編製的程序降溫。首先將經冷凍保護劑處理的胚胎以較慢速度（1℃/min）降溫至-7℃，平衡10min後，在此溫度誘發結晶，再平衡10min，以0.1～0.3℃/min的速度降溫至-36℃以下，投入液氮中保存。按這種方法凍存的胚胎解凍時需要慢速升溫（4～25℃/min）。脫去冷凍保護劑的濃度方向與冷凍時相反，按相同濃度梯度，從高濃度向低濃度進行。常用的冷凍保護劑一般為二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide，DMSO）、氨基酸、丙三醇、1，2-丙二醇（PROH）等。
常規冷凍法的優點是細胞脫水完全，細胞內不易形成冰晶；缺點是很費時，冷凍保護劑處理胚胎的時間過長，同時設備昂貴。
2.玻璃化冷凍法玻璃化冷凍法（vitrification）是Rall 和Fahy於1985年建立的一種快速，簡捷有效的超低溫冷凍方法。這種方法采用的高濃度冷凍保護劑組成的玻璃化液（滲透和非滲透性保護劑相結合），在低溫下變黏稠，不發生結晶即可固化，此固體物質能保持分子和離子正常的液態分布，是一種超快速冷凍模式。玻璃化冷凍保護液中的一般組成為：20.5%DMSO、15.5%乙酰胺、10%丙二醇和6%乙二醇。將胚胎在這種玻璃化液中處理以後，可直接投入液氮中保存。玻璃化冷凍保存的胚胎，解凍時需要快速複溫。
玻璃化冷凍法簡化了冷凍過程，凍存效果好，而且這種方法不需要冷凍儀器，設備簡單，費用少。
超低溫長期保存胚胎對生命科學的發展具有重要實際意義。該技術可應用於胚胎庫的建立；優秀品種、品係動物的種質保存；為胚胎工程技術提供可用胚胎；保存基因庫，免受遺傳汙染及遺傳漂變的危害；實驗動物的生物淨化和育種等多個方麵。而且，胚胎保存還有利於方便及時地進行地區和國際交流。
多年來，人們通過不斷探索，使玻璃化冷凍技術在近20年得到了蓬勃發展，已在多種實驗動物上試驗成功。但是關於冷凍對細胞核的影響和胚胎冷凍的基礎性研究還比較欠缺。例如，冷凍過程對於細胞形態和代謝的影響還需進一步深入研究，這對於製定可行的冷凍保存方案特別重要。
二、胚胎分割與胚胎嵌合
（一）胚胎分割（embryo bisection）
胚胎分割是通過對胚胎的顯微操作，將一個胚胎的細胞分成2組或多組，經修複、發育後再移入受體，最終得到同卵雙胞胎或多胞胎的過程。胚胎分割是擴大胚胎利用率的一種有效途徑，已經先後在小鼠、兔、綿羊、山羊等多種動物上試驗成功。
1901年，Spemann將蛙第一次卵裂後的2個卵裂球分離開，首次人工地產生了雙胞胎。1970年，Mullen等將小鼠2細胞期胚胎的2個卵裂球分離開，經培養後再移植給受體，產生了哺乳動物的第一例人工雙胞胎。1978年，Moustafa等又成功地將小鼠桑葚胚一分為二，得到雙胞胎。目前用胚胎分割法已克隆出小鼠、家兔、山羊、綿羊、豬、牛、馬等。
根據胚胎發育階段不同，胚胎分割的操作有2種方式，一種是在8細胞階段以前，將每個卵裂球（2～4細胞階段）或2個卵裂球（4或8細胞階段）作為一組，分別放入一個空的透明帶內，繼續發育成一個胚胎；另一種方式是對桑葚胚至囊胚期的胚胎進行分割，然後把每一份放入一個空的透明帶內。後一種操作方式現已發展出多種切割方法，如顯微玻璃針去帶分割法、顯微手術刀直接分割法、酶消化透明帶顯微玻璃針分割法、酶-機械去帶分割法和徒手刀片分割法等。
1.顯微玻璃針去帶分割法在顯微操作儀下固定胚胎，用顯微玻璃針摘除透明帶，然後對裸露胚胎進行切割。
2.顯微手術刀直接分割法同樣在顯微操作儀下固定胚胎，直接用顯微手術刀切割胚胎。
3.酶消化透明帶顯微玻璃針分割法先用含0.5%鏈黴素蛋白酶的Hanks 溶液孵育胚胎，待酶將透明帶消化後，再用顯微手術刀切割胚胎。
4.酶-機械去帶分割法先用酶軟化透明帶，然後用玻璃管去除外層透明帶，最後用顯微手術刀將胚胎分割成2分胚胎、4分胚胎等。
5.徒手刀片分割法先用0.25%鏈黴素蛋白酶軟化胚胎1min左右，再用2%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和PBS 溶液洗滌2次，然後使用專用手術刀徒手分割胚胎。
嚴格來說，胚胎分割法克隆並不是真正意義上的克隆。但是胚胎分割可使胚胎數量成倍地增長，這一點對繁殖率低、世代間隔較長的單胎動物尤為重要；胚胎分割還可得到同卵雙生動物作為理想的實驗研究材料，並且可用於動物性別鑒定和性別控製，可極大提高胚胎移植的實際效果。
（二）胚胎嵌合
胚胎嵌合是指將2枚或者2枚以上胚胎（同種或者異種動物胚胎）的部分或全部細胞融合在一起，使之發育成一個胚胎，並移植入受體使其繼續發育，最終獲得具有2種動物細胞的嵌合體後代。
1961年，Tarkowski將白色的SJL近交係小鼠與黑色的C57BL/10近交係小鼠的8細胞期胚胎在體外進行融合，然後移入假孕小鼠子宮內，首次培育出黑白斑雜合的人工嵌合體小鼠後。1965年，Mintz將其方法進行改造，第一次得到了活至成年的正常嵌合體小鼠。1970年以來，相繼獲得了小鼠、大鼠、兔的嵌合體。1984年，英國科學家成功培育出山羊和綿羊胚胎嵌合體動物——綿山羊。我國科學家中山大學的陳係古教授也於2000年培育成功了黑白相間的嵌合體小鼠。目前得到的種間嵌合體動物有小鼠-大鼠嵌合體、綿羊-山羊嵌合體、馬-斑馬嵌合體、牛-水牛嵌合體。
胚胎嵌合的方法有2種。一種是聚合法，目前已廣泛應用於實驗動物。一般是把8細胞至桑葚胚前期的胚胎去掉透明帶後，將2個胚胎的卵裂球聚合在一起，形成一個胚胎，經體外培養發育至囊胚階段，再移植給受體。另一種是注射法，即把細胞注入到囊胚腔內。注射用細胞可以是卵裂球，也可以是發育後期胚胎細胞，甚至可以是畸胎瘤細胞和胚胎幹細胞（embryonic stem cells，ES 細胞）。
嵌合體實驗動物可以作為發育生物學的研究材料，也可以用來建立遺傳疾病動物模型。另外，胚胎嵌合對於實驗動物育種與瀕危動物的挽救也有實際意義。
三、胚胎幹細胞技術
幹細胞是一類具有自我更新（self-renewing）和分化潛能的細胞，其發育受多種內在機製和微環境因素的影響。根據其發育階段，幹細胞分為胚胎幹細胞（embryonic stem cell）和成體幹細胞（adult stem cell）。
胚胎幹細胞是一種存在於早期胚胎的具有發育全能性的細胞，它可以自我更新並分化為體內所有類型的組織細胞，包括生殖細胞。胚胎幹細胞的分化和增殖是動物發育的基礎。早在20世紀60年代，人們就發現小鼠畸胎瘤中存在著未分化的多能性幹細胞，在適當的條件下它可形成多種細胞類型。因為畸胎瘤是原始生殖細胞癌變而形成的，因此把這種多能性幹細胞稱為胚胎癌細胞（embryonal carcinoma cells，EC）。但是EC細胞常常表現出某些惡性腫瘤的特征，它的染色體核型異常，分化潛能也有限，而且不能參與嵌合體動物生殖細胞的形成，並經常在嵌合體中形成腫瘤或導致胚胎早期死亡，因而人們開始尋找別的適合分離多能性幹細胞的材料。研究人員嚐試著從原始生殖細胞中直接分離未分化的多能性幹細胞，研究結果表明，原始生殖細胞中確實含有多能性幹細胞。這些細胞在體外適宜的環境中可以較長期增殖，並維持未分化狀態，在不同信號刺激下可以分化為多種細胞類型，這種多能性幹細胞被稱為胚胎生殖細胞（embryonic germ cells，EG）。1981年，Evans和Martin等首次成功地從延遲著床的小鼠胚胎中建立了多能性幹細胞係，這些細胞具有正常的二倍體核型，並可分化為多種細胞類型，被稱為胚胎幹細胞（embryonic stem cells，ES）。