9月初，天氣漸漸涼爽下來，人們也心平氣和了，賴特生物研究中心又出現了往日的氣息。一天，弗萊明來到實驗室，準備看一看他度假前擱放在工作台上的一堆盛有培養液的器皿。他望著已經生毛發黴的試驗器皿深感追悔未及，本應該在度假之前就把這些東西收拾好，使它們保持幹淨，但後悔也沒用了。於是，他像從前一樣想把器皿中的實驗物倒掉，以便重新開始工作。
就在臨倒之前，弗萊明又仔細地看了看主要的幾個器皿，忽然他發現其中長有青黴的器皿中，青黴點周圍十分清澈，以前在這裏培養的葡萄球菌全都不見了！也許由於弗萊明腦子裏已經有了溶菌酶的概念，特別是有經曆失敗後所獲得的寶貴經驗，因此，他對這一發現並沒有驚訝。他推測：大概是青黴能分泌特殊的殺菌素，把葡萄球菌全部殺死了。於是他決定將這些菌落進一步培養觀察，並對它們作進一步深入的研究。
在研究中，弗萊明偶然想起兒時的一段往事：有一天他不小心劃破了手指，母親取來已發黴的麵包上的青黴，塗抹在他手指的傷口處。當時英國民間盛行這種用發黴麵包上的青黴治療割傷的辦法。弗萊明把這段往事與他的研究聯係起來，心想：“能不能用青黴分泌物來做殺菌藥品呢？”於是，弗萊明又投入到實驗室中，他將黴菌菌落在常溫下放在器皿中培養了5天，再將其他多種生物培養液以條狀穿過菌落，然後再用培養液加以培養。他在筆記本上記錄了如下結果：“某些生物體直接朝黴菌生長，甚至越過並覆蓋住了黴菌，而葡萄球菌卻在黴菌前2．5厘米處停下了。”在隨後的一次試驗中，弗萊明向裝有混濁的葡萄球菌懸殊體瓶中又加入一些黴菌培養液，發現3小時後懸珠體混濁液開始變清，說明葡萄球菌已被殺死。
後來，弗萊明在他那灰色布麵的實驗記錄本上，寫下了這樣一句使他譽滿全球的一段話：“這表明在黴菌培養液中包含著對葡萄球菌有溶菌作用的某種物質。”這種抗菌物質後來被命名為盤尼西林，即青黴素。
從表麵上看，弗萊明發現青黴素的過程應歸功於偶然或意外帶來的機遇。在科技史上，這種由偶然導致發明創造的事例比比皆是。如阿基米得在洗澡時發現了浮力定律；古德伊爾在實驗室意外發現橡膠硫化工藝；魯班在上山的路上產生了發明鋸的思路……其實，這些表麵的偶然性中隱藏著必然性，那就是發明家對問題的長期深入思考和執著的追求。沒有一定的積累和知識基礎，即使機遇到眼前也是抓不住的。
機遇並不為發明者提供現成的科技成果，它僅是起到開啟發明家的創造思路，為探索者提供獲得新發現的機會。巴斯德曾說過：“機遇隻偏愛那種有準備的頭腦。”因此，作為發明家就應該時常保持有準備的頭腦，時刻留心“意外之事”，一旦機遇出現，就能夠認出它、抓住它、探索它、利用它，沿著機遇啟示的思路，解決自己所麵臨的問題。弗萊明就是一位善於把握機遇的人，所以他會成功。
繼續登攀——由發現到發明
發現隻是一種認識活動，它的目的是通過觀察和實驗來找出自然界事物或現實的某種規律，獲得知識。但人的實踐活動隻有認識還不行，它必須利用這些認識成果來改變自然，為人類造福，這就需要將發現轉化為發明。在實驗室裏認識到青黴菌中的某種物質可以殺死病原菌後，醫生的任務並沒有完成，他還要想辦法提取這些物質，並把它們做成可實用的藥品，而且還要保證可以在工廠中批量生產。
這之中還有更複雜的工作等著人們去做呢！葡萄球菌是一種可以致病的細菌，許多疾病都是由它引起的。所以，青黴素的發現使弗萊明異常興奮。他和年輕的助手德利·克萊道克一起開始研究青黴菌的活動規律。發現這種青黴菌能夠生存在許多不同的生物體中，生命力極強。把它稀釋後，注射到健康的白鼠身上，證實沒有任何副作用。一係列試驗結果簡直使弗萊明高興極了。他認為青黴素正是他長期夢寐以求的“完美無缺的抗菌劑”。
1929年5月，弗萊明正式發表了關於青黴素研究的論文。然而，論文的發表並沒有給弗萊明立即帶來讚揚和榮譽，相反，青黴素的試驗又傳來了不祥的消息。這些試驗顯示了青黴素的致命弱點：青黴素花4個多小時才能把細菌殺死；在有血清存在的情況下，青黴素幾乎完全喪失殺菌能力；如果將青黴素液通過靜脈注射到兔子身上，它30分鍾之後就會在兔子的血液中消失，並不能穿過感染的組織，因而不能將表層下麵的細菌消滅。
這些試驗結果使弗萊明把青黴素作為一種全身或局部性抗菌劑的希望破滅了。麵對困難，弗萊明感到，繼續研究青黴素在臨床上的使用，恐怕是一件得不償失的事了。此外，青黴素液是由青黴菌製成的，而青黴菌數量極少，要利用它作醫藥，這是不可能的。如果以化學合成的辦法來製造，必須先進行分離、精製等工作，還要闡明其分子結構。當時一位生物化學家開始致力於這項工作，但最後沒有成功。