1935年6月，紅一、四方麵軍在四川懋功會師。不久，部隊進行整編，周子昆留在紅軍總部工作。同年11月，他任紅軍大學高級指揮科科長。
1936年6月周子昆調任紅軍總部一局局長。他每天和毛澤東、朱德、彭德懷等人一起，研究行軍作戰方案。
1936年10月，紅一、二、四方麵軍在甘肅會寧勝利會師。周子昆於1937年1月調到中國人民抗日軍政大學一隊學習，並任一隊隊長。抗日戰爭全麵開始後，黨中央派周子昆參加新四軍的組建工作。
1937年冬的一天，在延安棗園，毛澤東、林伯渠等領導人同周子昆等三十多名幹部一一握手告別。毛澤東握著周子昆的手，微笑著說：“你是井岡山的教頭，此去江南，開展遊擊戰爭，大有英雄用武之地啊！”周子昆告別延安，風塵仆仆地奔赴南昌，協助葉挺、項英組建新四軍。
1938年1月6日，新四軍在南昌正式成立，周子昆任副參謀長。新四軍初創時，困難很多。當時堅持遊擊戰的部隊下山時都是頭發胡子蓬亂，穿著破爛不齊。為了解決部隊的困難，周子昆和其他領導同誌一起，一方麵做國民黨地方當局的工作，爭取到一些軍服、糧餉，一方麵發動部隊自力更生，自己動手解決困難。敵占區的地方黨組織和進步團體，也募捐到一批物資，從而使分散在贛、粵、鄂、湘、豫、皖、浙、閩八省十三個地區的紅軍遊擊隊，僅用三個月時間，便完成集中整編和戰略展開的任務。全軍分成四個支隊，分別挺進蘇南、皖中、皖南敵後，建立抗日根據地，開展遊擊戰爭。
1939年春，新四軍教導總隊宣告成立，周子昆兼任總隊長。這時，參謀長張雲逸已轉到新四軍江北指揮部工作，周子昆實際上擔負起了參謀長的職責，工作極為繁忙。為了培養幹部，提高部隊的戰鬥力，他總是親自參與教導總隊製訂教育方針、教學方案，組織閱兵、會操、演習等重大活動，還親自講授一些重要的課程和給學員作示範動作。由於他的努力，教導總隊為全軍培養出一批優秀的軍政幹部。
在新四軍挺進敵後的日子裏，周子昆協助葉挺、項英指揮各部隊向日偽發動進攻，取得了一次又一次的勝利。
作為軍的副參謀長，每次重大戰鬥，周子昆總是在前線指揮。1940年10月，日軍出動一萬餘人“掃蕩”皖南，矛頭直指新四軍軍部，周子昆協助葉挺指揮部隊迎擊。敵軍進攻失敗後，惱羞成怒，派飛機來狂轟濫炸。突然一枚炸彈落在溝旁，周子昆被炸起的泥土埋了半截身子。警衛員把他拉起來，他站起來拍掉身上的塵土，風趣地說：“奉係軍閥打傷我的手，國民黨軍打傷我的肩，東洋鬼子想要我的命。要我死哪有那麼容易啊。”他看了看表，又鎮定自若地指揮作戰了。這次戰鬥，我軍殲敵一千多人，收複了涇縣縣城。
1941年1月上旬，國民黨反動派用十倍於我軍的兵力伏擊新四軍軍部和直屬部隊，製造了震驚中外的皖南事變。部隊經過七天七夜的激烈戰鬥，終因彈盡糧絕，寡不敵眾，被迫分散突圍。周子昆、項英和十幾名參謀、警衛人員突出重圍後，隱蔽在大觀山上。沒有飯吃，沒有水喝，靠吃玉米芯、草根，喝山泉、雨水過日子。在極端困難的情況下，他仍勉勵大家：“不管革命有多少艱難險阻，一定是會成功的。我們那怕隻剩下一個人，也要衝出去繼續戰鬥！”周子昆在大觀山一帶隱蔽了兩個月，積極設法伺機北渡，不幸於1941年3月13日和項英一起被叛徒殺害於赤坑山蜜蜂洞內。