脂肪幹細胞輔助自體顆粒脂肪移植術研究進展
綜述
作者：劉乃軍等
在腫脹技術注射器吸脂和傳統單純自體顆粒脂肪注射填充移植[1]及脂肪組織源性幹細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）等[2]實驗與臨床研究基礎上，2006年，Matsumoto等[3]提出ADSCs協同自體脂肪移植（cell-assist ed lipotransfer，CAL）概念，Yoshimura等[4]同期應用CAL成功進行了臨床隆乳術；2008年，劉乃軍等[5]在上述CAL基礎上，提出幹性CAL和濕性CAL概念，並應用濕性CAL技術成功進行了臨床多量自體顆粒脂肪移植，臨床獲得明顯提高[6]。現就ADSCs技術在臨床顆粒脂肪注射移植方麵的研究進展綜述如下。
1 傳統單純幹性和濕性顆粒脂肪注射移植方法
過去27年裏，在濕性腫脹技術和注射器吸脂等基礎上[7]，傳統單純自體顆粒脂肪注射移植方法分為（離心法）幹性移植法[8-9]（應用離心技術分離濃縮純化顆粒脂肪）和（靜置法）濕性移植法[10-11]（不用離心技術而是采用自然靜置懸浮反複漂洗析出水分等雜質純化顆粒脂肪）；迄今兩者仍是臨床最常用的操作流程，公認為安全、有效的治療方法，但有關顆粒脂肪注射移植術後存活率各家報道不一，且爭議較大，要真正建立公認的臨床規範標準化操作流程，仍需做出更多改進[12-13]，目前，我國自體顆粒脂肪注射填充移植技術已經進入世界先進行列。
2 自體ADSCs和SVF來源
近年研究證實，在人體吸脂顆粒脂肪懸液中獲取的多向分化ADSCs是安全理想的自體細胞來源[14]，2007年，朱茗和高建華等[15]實驗研究從成人脂肪抽吸物液體部分中分離得到大量可為脂肪組織工程所利用的ADSCs，其細胞量與脂質來源的量基本相同。2009年，Yoshimura等[16-17]實驗研究吸脂抽吸物獲得大量自體血管基質層片段細胞（stromal vascular fraction，SVF）。2010年，付冰川和高建華[18]等實驗研究認為新鮮SVF與培養的ADSCs一樣，可提高脂肪移植物存活率，前者操作更方便、省時、安全、高效，後者難以滿足臨床實際需要；其實，通過吸脂術獲得顆粒脂肪內血管間質碎片（SVF）“微粒”含有多種類型多功能幹細胞，其中就包括ADSCs，新鮮SVF直接添加到顆粒脂肪移植混合填充物中，不需額外處理，對顆粒脂肪移植混合填充物較少人工處理，更能改善脂肪細胞、ADSCs、SVF活性，額外人工處理純化方法與脂肪細胞、ADSCs、SVF的細胞數量和活性無關，新鮮ADSCs和SVF可自然混合在顆粒脂肪移植填充物中，直接注射填充移植為脂肪組織工程所利用[19]；目前，雖很難證實新鮮ADSCs和SVF細胞準確數量及對體內移植顆粒脂肪在構建脂肪組織過程中確切輔助作用機製，關鍵是可避免體外離心濃縮及分離培養ADSCs和SVF過程中可能出現細胞基因變異問題[20]。關於ADSCs的應用，目前仍有許多重要問題有待探索解決，首先ADSCs在無免疫力的移植受體上表現出的腫瘤樣無限增生特性，在進入臨床實驗前仍需尋找並建立合適動物模型進行長期觀測以確定其移植後安全性；其次，在批量提取生產ADSCs過程中，如何保障細胞質量均一穩定仍然有待深入研究。
3 離心法與靜置法對ADSCs和SVF的影響
對於吸脂抽吸物是否需要離心，迄今仍有很大爭議，一些學者一直倡導采用自然靜置懸浮漂洗或不漂洗法，另外一些學者則主張離心分離濃縮純化法；目前臨床還無公認合理的離心速度，Kurita 等[22]認為過快離心速度反而會破壞ADSCs完整性[21]；楊東運等認為低速離心並不能顯著提高麵部自體顆粒脂肪移植存活率；雷華等[23]認為大於等於600rpm均會損傷顆粒脂肪活性，建議顆粒脂肪移植慎用離心法，宜采用靜置法，以最大程度保護顆粒脂肪免受損傷。2011年，Botti等[24]經長期臨床驗證認為注射移植的顆粒脂肪細胞其吸收、存活情況與脂肪離心分離濃縮純化技術無關。研究表明，顆粒脂肪離心分離濃縮純化方法與細胞數量和活性無關，注射器法吸脂吸出的顆粒脂肪不必進行離心和漂洗，宜采取自然靜置懸浮法析出無用水分和雜質，最大程度保護顆粒脂肪混合填充物免受損傷[25]。
4 ADSCs和SVF體外提取分離培養過程及存在問題
ADSCs和SVF體外分離、提取、培養、製作、注射為一體的處理過程均需在高標準無菌手術室和淨化室采用專用設備完成[26]。操作複雜繁瑣成本高，ADSCs誘導液常含有與腫瘤發生轉移有關的生長因子，且價格昂貴不易推廣普及[27]。將離心濃縮純化後顆粒脂肪與體外分離、培養的ADSCs和SVF細胞混合填充物複合同步移植，該項技術尚不成熟，目前仍處於進一步研究階段。關於ADSCs和SVF的臨床應用，目前仍有許多重要問題有待探索解決，《藥品生產質量管理規範（2010年修訂）》（簡稱新版藥品GMP） 認為幹細胞治療需要嚴格按照藥物研發的一般流程，包括研發篩選、臨床前研究、臨床階段、新藥批準上市幾個主要階段[28]，當前FDA和SFDA還未批準分離培養的ADSCs和SVF用於任何臨床領域。目前為止，幹性CAL技術主要是在體外細胞培養皿及試管中或動物身上進行實驗研究，須經由嚴謹人體試驗證實，不但要有穩定成活率和肯定療效，而且還要有標準統一的質量控製和臨床治療規範化管理，隻能允許有限的人體可忍受，不影響健康的副作用和無嚴重並發症發生，不改變受植區組織結構、不幹擾受植區成像、不影響受植區惡性腫瘤篩查、不幹擾受植區惡性腫瘤診斷，在這些條件完全具備後方可臨床推廣應用。幹性CAL目前在臨床治療上並沒有太大實際價值，進入臨床應用前仍需慎之又慎，切勿盲目過早開展臨床應用。進入臨床試驗前仍需尋找並建立合適動物模型進行長期觀測以確定其移植後安全性，特別是目前還無法保證經離心後體外分離培養的ADSCs和SVF是否出現細胞基因變異瘤化問題；有研究顯示，長時間培養的ADSCs可使免疫缺陷小鼠發生腫瘤[29-30]。目前尚無一安全穩定並行之有效的培養、誘導方式，以及在批量提取生產ADSCs和SVF過程中，如何保障細胞質量均一穩定性，有待進一步研究。
5 幹性CAL和濕性CAL主要區別及臨床效果
主要區別在於幹性CAL是應用離心技術分離濃縮純化自體顆粒脂肪及體外分離、培養ADSCs和SVF，手術需二次完成，難以滿足臨床需要，還沒有經過嚴格循證醫學的臨床對照研究檢驗，另外還有一些倫理道德方麵問題需探討。劉曉燕等[31]臨床應用ADSCs（幹性CAL）治療麵部老化症和麵部凹陷症，局部症狀明顯改善，但長期效果尚待進一步觀察。濕性CAL是不用離心技術去除吸脂抽吸物液體和脂質中大量ADSCs和SVF，不體外分離培養ADSCs和SVF（注射器內自然靜置懸浮不漂洗法），新鮮ADSCs和SVF自然混合在顆粒脂肪填充物中直接注射移植，手術可一期完成，操作簡易、快速、安全、經濟、並發症少；濕性CAL是未離心分離培養的新鮮ADSCs和SVF“微粒”與顆粒脂肪混合填充物複合同步移植，臨床技術基本成熟，規避了許多體外培養細胞移植倫理道德方麵問題，經過了嚴格循證醫學的臨床對照研究和檢驗，有26年傳統單純自體顆粒脂肪（幹性/濕性）注射移植經驗可借鑒[32]。
2011年，魯峰[33]采用新鮮獲得SVF，不體外分離、培養ADSCs和SVF，一次完成臨床手術，治療11例，認為新鮮幹細胞輔助能提高遊離移植脂肪組織存活率，是一種安全有效的治療軟組織缺損方法。除此之外，幹性CAL和濕性CAL在抽取顆粒脂肪和注射移植過程中均符合“三低三多” 顆粒脂肪注射移植原則和“3L3M”技術規則[34]。如果幹性CAL效果並不優於濕性CAL，那我們一定更願意選擇操作簡便、效果安全可靠的濕性CAL方法，濕性CAL初步解決了製約單次多量顆粒脂肪注射移植術後存活率的重要難題，公認的標準化濕性CAL操作流程應該是：①吸脂術：采用手工注射器注射腫脹液（盡量避免壓力過高過快）和注射器吸脂法；②製備新鮮濕性顆粒脂肪及幹細胞“微粒”混合填充物：20ml螺口專用一次性注射器和1.5～2mm無創吸脂針吸脂，每次吸滿一支注射器畢，將注射器直立自然靜置懸浮後隻排出注射器內顆粒脂肪下層少許水分（若水分很少，亦可不排出），不撥除注射器芯，將吸脂抽吸物由注射器桶後口傾倒入生理鹽水盆中懸浮漂洗顆粒脂肪抽吸物，不排出靜置後注射器內顆粒脂肪上層脂質（油脂）部分，不離心濃縮純化分離顆粒脂肪和幹細胞“微粒”，不排出注射器內自然靜置後混合填充物微粒間液體部分（因其內富含未經分離新鮮ADSCs和SVF），直接注射填充移植用；③濕性CAL隆乳和隆臀及隆乳假體取出後即刻注射隆乳術：注射移植前受區先局部腫脹浸潤麻醉（0.125%鹽酸利多卡因含1：1000000腎上腺素溶液） 使各層次組織液壓膨脹和疏鬆無創分離，並根據注射腫脹液體積量計算出濕性填充物微粒注射需要量，實際注射量要比受區注射需要量再增加30%～50%體積，注射填充過枉矯正；單點微量（0.5～1ml）、多點、多隧道（在形成隧道退針同時注射，將顆粒脂肪和幹細胞“微粒”定位於受植床內）、多平麵注射，隆乳注射量為120～180ml/側，隆臀220～360ml/側，局部肌肉內可分多層注射以保證良好血運和盡量減少損傷；④體表局部凹陷及麵部多量自體顆粒脂肪注射填充移植：可根據受區具體情況個性化處理後，多量自體顆粒脂肪注射方法同上，局部凹陷重點是采用肌肉內分多層注射以保證良好血運和盡量減少損傷，濕性CAL美容性豐麵，重點是采用全麵部深層肌肉內多層次注射移植，注射量為100～160ml/例。因矯枉注射填充，受區術後早期有明顯腫脹，術後48h內可間斷冰敷， 72h後可局部熱敷理療，1周內均恢複自然；濕性CAL均采用單次注射填充移植完成， 無需重複注射移植即可達到較為滿意的治療效果；截止目前，這是含有自體新鮮ADSCs和SVF輔助多量顆粒脂肪注射填充移植操作最簡單、顆粒脂肪和幹細胞“微粒”損傷最輕、受區血運條件最佳、安全合理的臨床標準規範操作流程之一，從注射腫脹液到顆粒脂肪抽吸畢，顆粒脂肪注射填充物加工完成，注射到受區至術畢，這段規範公認的標準化操作流程時間，在操作醫生安全可控範圍內，操作時間越短，顆粒脂肪填充物所含脂肪細胞、ADSCs、SVF等活性越高；反之操作時間越長，細胞活性會隨時間延長而越來越低[35]。