組織工程技術在陰道成形術中的應用
綜述
作者：伊家嘉等
陰道成形術常用於先天性無陰道、陰道閉鎖、兩性畸形、後天會陰部損傷、腫瘤切除後盆腔清掃造成的陰道缺如，以及男性要求女性化者，它是解決先天及後天無陰道患者性生活和性角色的根本途徑。理想的陰道成形術是為患者再創造一個解剖和功能均接近正常的陰道。從宮頸口到陰道口深度達7cm，可容納兩指寬，內壁柔軟，有分泌物，不發生攣縮，不破壞外陰形態，對機體不造成大的損傷，不遺留顯著瘢痕。目前，人工陰道成形術有多種方法，最基本的是在尿道、膀胱和直腸之間形成人工腔穴，利用各種不同的覆蓋物納入腔穴形成人工陰道。常用的手術覆蓋物有皮片、皮瓣、肌肉瓣、膀胱瓣、腸袢、腹膜等自體組織以及羊膜、胎兒皮膚等異體組織。這些技術在創造了陰道的同時會導致一些並發症，如腸粘連，大量粘液分泌或無分泌物，毛發生長，繼發狹窄、攣縮及瘢痕等[1]， 異體組織移植往往隻充當暫時性覆蓋物並可能引起排斥反應。不通過人工造穴形成人工陰道的術式有頂壓陰道成形術和外陰陰道成形術等，而頂壓法受先天條件限製，外陰陰道成形則外陰形態改變明顯。此外，利用這些非陰道組織再造的陰道在功能上有一定的局限性，在形態學及組織學方麵與正常陰道組織差別也較大。因此，探索和改進陰道成形方法是必要而迫切的[2]。組織工程技術采用自體細胞體外培養擴增的方法使組織器官再造成為可能，它對機體損傷小，組織形態和正常組織相似，具有廣泛的應用前景，現將陰道組織工程技術的國內外研究方法與進展綜述如下。
1 陰道組織工程中的種子細胞
1.1 頰粘膜：Lin [3]成功地應用自體頰粘膜為8例患有MRKH綜合征的患者進行了陰道再造術。取出2cm×7cm的自體全厚頰粘膜片，在粘膜片上打針孔樣的洞以增加移植物的麵積，將其固定在陰道處造的腔穴中，粘膜片邊緣與小陰唇及周圍皮膚縫合，放入模具。這是首例應用自體頰粘膜進行的陰道再造術。Oakes等[4]首次用自體頰粘膜片對一位曾行結腸陰道再造術後繼發狹窄的患者進行了二次陰道成形術獲得成功，證明頰粘膜是陰道再造的良好材料。這為頰粘膜作為種子細胞應用於組織工程陰道再造提供了思路。趙穆欣等[5]也應用自體頰粘膜微粒移植進行了陰道再造。他將頰粘膜剪成0.5mm的微粒並移入尿道與直腸之間造的腔穴中。術後陰道深6～10cm，容納兩指寬，人造陰道粉紅色，表麵光滑，組織病理學示未角化的複層扁平上皮粘膜層，供區愈合良好。利用自體頰粘膜進行陰道再造術為自體頰粘膜作為種子細胞應用於陰道組織工程奠定了基礎。李森愷等[6]用口腔粘膜微粒進行陰道重建，口腔粘膜微粒是補充粘膜缺損的良好材料，成活容易，生長迅速，術後收縮較小，可以應用於部分尿道重建和陰道重建等被覆粘膜結構器官的再造。他采用明膠海綿承托口腔粘膜微粒遊離移植的方法行陰道再造術。點狀采取直徑為5mm口腔粘膜片剪成直徑小於1mm的微粒備用。口腔創麵填塞碘仿紗條放置。將獲取的粘膜微粒均勻地塗在幹燥的明膠海綿上。陰道再造時，陰道諸壁各用1片明膠海綿承托的粘膜微粒覆蓋。多孔矽膠模具中填塞碘仿砂條固定。采用這種方法，陰道深6～10cm，寬能容窺具，粘膜光滑紅潤，彈性好，近陰道外口陰道壁可見皺襞，病理示複層鱗狀上皮，外陰外觀與正常女性相似，無任何手術痕跡。口腔內供粘膜區域無繼發畸形，張口不受限，感覺正常[7]。頰粘膜取材方便，供區範圍較廣，創傷小，風險低，不留並發症或繼發病理改變，組織學形態與正常陰道粘膜相似且組織相容性好，是組織工程應用於陰道再造的良好種子細胞。
1.2 陰道組織
1.2.1上皮細胞及平滑肌細胞： Roger[8]將體外培養的兔陰道上皮細胞和平滑肌細胞分別種植於PGA支架的內外兩麵，植入裸鼠皮下繼續培育，免疫組化染色顯示所形成的工程化組織中上皮細胞角化蛋白AE1/AE3抗體及SM-o-actin抗體陽性，其染色的形態和強度與正常陰道組織相似，植入人體內6周後呈現顯著的層次結構。同時觀察到受體血管浸潤現象，還可見平滑肌細胞呈現肌束樣結構，而未種植細胞的對照組支架毫無組織形成的跡象。此外，該組織表現出與正常陰道組織相似的對電刺激產生特有的收縮反應且振幅相似。提示其與正常陰道組織表型、組織學和功能相似，然而研究表明陰道粘膜上皮細胞和平滑肌細胞在體外增殖能力有限。多次傳代後細胞易老化，因而不甚理想。
1.2.2陰道粘膜細胞：Pierluigi等[9]首次將自體陰道組織移植用於Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser 綜合征（MRKHS）患者的陰道再造。他在患者的陰道前庭取出1cm2的粘膜全層用酶消化後塗於IV型膠原支架上培養，2周後患者行改良的Abbe-McIndoe陰道成形術並將體外培養的324cm2自體陰道組織覆蓋於陰道壁上。術後1個月，陰道的深度和寬度與正常陰道相似。用自體陰道前庭作為種子細胞的供區，患者損傷小，不留永久性瘢痕，避免異體組織移植發生排斥和感染的可能性；但供區有限，遠期效果不詳。
1.2.3人陰道成纖維細胞：人陰道成纖維細胞（Human Vaginal Fibroblasts，HVFs）的優點在於容易獲取並進行體外培養和擴增。 Man等[10]發現HVFs進行2、3次傳代後獲得的細胞依然具有與同源細胞相同的典型形態。用傳代HVFs作為種子細胞用於組織工程製造筋膜替代物來填補缺陷組織，支持懸浮器官，如陰道再造，盆腔器官脫垂等。
1.3 幹細胞
1.3.1骨髓幹細胞：骨髓幹細胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs）向粘膜上皮細胞分化迄今已有較多文獻報道，體外誘導BMMSCs分化為口腔、氣道、胃腸道、輸尿管等粘膜上皮細胞。在體內亦可分化為粘膜上皮細胞，參與粘膜炎症等損傷後的修複。Visaget[11]將人BMMSCs與人支氣管上皮細胞共培養一段時間後，前者形態改變呈上皮細胞樣的立方形並具有纖毛樣的附屬結構，間接證明了BMMSCs可用於陰道組織工程的可行性，構建組織工程化陰道所需的粘膜上皮細胞和平滑肌細胞理論上可由BMMSCs分化而來，可用於陰道組織工程的支架材料有聚羥基乙酸（polyglycolide，PGA）、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物（polylactic-co-gl ycolic acid，PLGA）、小腸粘膜下層（Small Intestinal Submucosa，SIS）等，已有較多文獻報道BMMSCs在這些支架材料上粘附牢靠，增殖旺盛。這些均提示BMMSCs可用作陰道組織工程的種子細胞[12]。然而BMMSCs取材較少，成功的誘導分化為上皮細胞和平滑肌細胞並大量增殖及粘附的技術有限，尚需進一步研究。
1.3.2 脂肪幹細胞：Brzoska[13]發現全反式維甲酸能夠誘導脂肪幹細胞（adipose derived stem cells，ADSC）向上皮係分化。Altman等[14-15]首次成功地將ADSC種植於脫細胞真皮基質（acellular dermal matrix，ADM）上，ADSC可以輕鬆地從皮下脂肪中獲得，手術損傷小，痛苦少，操作簡便。Hakan[16]將含有ADSC 的脫細胞真皮和不含ADSC的脫細胞真皮植入Fischer大鼠皮下。8周後，含有ADSC的脫細胞真皮的厚度和血管密度及膠原含量明顯高於未種植ADSC的脫細胞真皮。ADSC可以粘附於ADM上，它降低了移植物體內吸收率，具有更好的穩定性和持久性，改善ADM的種植效果。Nie [17]猜測在ADM上植入ADSC可通過旁分泌血管內皮生長因子（vas cular endothelial growth factor，VEGF）、轉化生長因子b（transforming growth factor，TGFb）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）和人類生長因子（human growth factor，HGF）有效地促進傷口愈合。Kim 等[18-19]的實驗記錄表明ADSC可以刺激成纖維細胞分泌膠原蛋白。任何無血管的有機材料盡管有些是自體的，它們也會因為缺乏營養和活性減退而在移植部位出現吸收的可能。所以有機移植材料的早期血管化和營養支持格外重要，可降低其吸收率。ADSC分泌的VEGF可促進早期血管化，提供營養，預防ADM吸收，因此，ADM是ADSC的良好支架，它具有抗感染，免疫豁免，可快速植入受區等特點，還可以用於腹部筋膜缺陷的治療，齶裂修補術和粘膜替代物。本實驗可為陰道再造和預防術後狹窄及攣縮提供思路。
1.3.3 陰道粘膜幹細胞：陰道粘膜幹細胞（vaginal mucosa stem cells，VMSC）存在於陰道粘膜上皮的基底層，具有高度的自我更新能力，在維持粘膜上皮細胞再生和修複方麵具有重要功能。王沂峰等[20]用VMSC作為種子細胞種植於人羊膜上，VMSC在負載物上能良好地生長，形成一層具有組織形態的薄膜，移入製備的無陰道小鼠體內，可用於修複缺損。然而陰道粘膜幹細胞取材有限，是否能大量增殖替代陰道粘膜有待研究。
2 陰道組織工程中的基質材料
2.1 脫細胞真皮：同種異體脫細胞真皮基質（acellular dermal matrix allograft，ADMA）采用特殊工藝去除表皮中引起排異反應的細胞成分，而保留了基底膜、細胞外基質等骨架結構，因此具有低免疫原性、不易吸收、易塑形等特點。廣泛應用於燒傷、口腔、耳鼻喉、整形等學科領域。陰道瘺修補術中應用ADMA不僅起到填補陰道內壁、加強支持作用，也能允許新生粘膜組織的無瘢痕愈合 [21]。RENOV補片是應用組織工程學技術，將異體組織通過脫細胞處理後得到的一種天然的細胞外基質，保留了細胞外基質成分及三維空間框架結構，是一種真皮替代品。2006年，朱蘭等[22]用RENOV醫用組織補片為5例患者行人工陰道成形術，術後第8周隨訪見人工陰道全長均已完全粘膜化。2009年，他們用組織工程醫用生物補片對小型實驗豬行陰道重建術，術後12周，陰道粘膜上皮細胞、平滑肌細胞及對電刺激的收縮反應均與正常陰道相似[23]。人造真皮是一種由纖維端膠原和熱變性端膠原組成的膠原海綿，植入活體內，宿主的上皮細胞和成纖維細胞就會長入這種膠原材料內並逐漸被宿主組織替代，最後形成了真皮樣組織。人重組堿性成纖維細胞生長因子（b fibroblast growth factor， bFGF）可以促進神經外胚層和中胚層的增殖及分化如上皮細胞和成纖維細胞，它們在組織再生和肉芽組織形成中起重要作用。人重組bFGF可以縮短創傷愈合時間，在Ⅱ度燒傷中加快上皮化，促進肉芽組織形成[24]。基於上述特點，Soichi等[24]用一種人造真皮（端膠原海綿）進行了陰道成形術。他將這種人造真皮固定在模具上，然後放進預先造好的陰道穴中固定。術後第10天，向患者陰道內噴灑人重組bFGF加快其上皮化直到第19天，可見陰道內有一薄層上皮樣的細胞覆蓋伴新生毛細血管形成，1/4的陰道粘膜完全上皮化類似正常陰道。術後50天，組織病理學示陰道完全被複層扁平上皮覆蓋，表麵光滑。Hakan等[16]將含有脂肪幹細胞的脫細胞真皮植入Fischer大鼠皮下，為探索組織工程用於腹部筋膜缺陷、齶裂修補術、粘膜替代物的材料也取得了良好效果。