Fig.1HPLC chromatograms of references and samples
2.4線性關係考察，檢測限和定量限分別精密量取0.5，1，2，4，6，8，10 mL的混合對照品溶液置於10 mL量瓶，精密稱取0.5，1，2，3，4，5 mL覆盆子苷-F5對照品溶液置於5 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，按2.3項中色譜條件進行HPLC分析，以峰麵積Y為縱坐標，對照品進樣量X為橫坐標，計算鞣花酸，異槲皮苷，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷，椴樹苷和山柰酚的線性回歸方程；以峰麵積的自然對數值ln（Y）為縱坐標，對照品進樣量的自然對數值ln（X），計算覆盆子苷-F5的線性回歸方程。
分別用甲醇將混合對照品和覆盆子苷-F5溶液稀釋一係列濃度，按2.3項中色譜條件進行HPLC分析，信噪比為3時的濃度為檢測限，信噪比為10時的濃度為定量限。目標化合物的線性回歸方程，相關係數（R2），線性範圍，檢測限和定量限，結果表明，各化合物在線性範圍內進樣量與峰麵積線性關係良好，方法靈敏度高。
2.5精密度試驗分別取混合對照品溶液和覆盆子苷-F5對照品溶液，進樣20 μL，連續進樣6次，在上述色譜條件下，測定相應化合物的峰麵積。鞣花酸、異槲皮苷、山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷、椴樹苷、山柰酚和覆盆子苷-F5峰麵積的RSD分別為1.4%，0.55%，0.57%，2.9%，0.63%，1.9%，結果表明儀器的精密度良好。
2.6重複性試驗取浙江馨安產地的覆盆子粉末5份，按2.2項操作，平行製備5份供試品溶液，按2.3項色譜條件測定，記錄峰麵積。鞣花酸，異槲皮苷，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷，椴樹苷，山柰酚和覆盆子苷-F5的峰麵積的RSD分別為2.4%，1.9%，2.7%，0.66%，0.93%。結果表明，化合物峰麵積的RSD均≤2.7%，本方法重複性良好。
2.7穩定性試驗取一份覆盆子粉末（浙江馨安），按2.2項操作，製備供試品溶液，室溫分別放置0，4，8，12，16，24 h，按2.3項色譜條件測定，記錄峰麵積。鞣花酸，異槲皮苷，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷，椴樹苷，山柰酚和覆盆子苷-F5峰麵積的RSD分別為0.58%，0.95%，0.36%，0.62%，1.0%，2.3%，表明供試品溶液在24 h內穩定。
2.8加樣回收率試驗分別精密稱取鞣花酸（300.73 mg），異槲皮苷（16.01 mg），山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷（138.08 mg），椴樹苷（97.89 mg）和山柰酚（5.68 mg）置於250 mL量瓶中，精密稱取覆盆子苷-F5（22.14 mg）置於25 mL量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，經 0. 45 μm 微孔濾膜過濾，即得鞣花酸質量濃度為1 202.9 mg·L-1，異槲皮苷64.1 mg·L-1，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷552.3 mg·L-1，椴樹苷391.6 mg·L-1，山柰酚22.7 mg·L-1的混合對照品溶液溶液和覆盆子苷-F5質量濃度為885.6 mg·L-1的對照品溶液。稱取已知含量的覆盆子（產地浙江馨安）藥材樣品9份，每份約1.25 g，分別加入1，2，3 mL混合對照品溶液，或1，2，3 mL覆盆子苷-F5對照品溶液，每個量3份，按2.2項方法進行樣品處理後，按2.3項色譜條件測定，記錄峰麵積，計算加樣回收率。結果顯示，鞣花酸，異槲皮苷，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷，椴樹苷，山柰酚和覆盆子苷-F5的平均加樣回收率分別為100.2%，97.11%，101.7%，99.20%，97.80%，98.37%，本方法準確度良好。
2.9樣品測定分別稱取16個產地覆盆子粉末，按2.2項操作製備供試品溶液，按2.3項方法進行分析，記錄峰麵積，測定藥材中6個化合物的含量。
3小結和討論
3.1樣品前處理方法的選擇本實驗考察了不同提取方法、提取溶劑、料液比及提取次數對本研究測定的6個化合物提取率的影響。以甲醇為提取溶劑，考察提取方式（超聲60 min提取2次，加熱回流60 min提取2次，冷浸過夜）對被測化合物提取的影響，結果表明超聲提取法提取較完全且方便快捷。用甲醇作為溶劑，超聲提取2次（60 min/次），考察料液比（1∶10，1∶20，1∶30）對藥材中被測化合物提取的影響，結果表明，料液比1∶20為較優提取條件。對比30%，50%，70%，90%甲醇及甲醇5個不同甲醇濃度，料液比為1∶20，超聲重複提取2次（60 min/次）條件下，對6個化合物提取率的影響，結果表明70%甲醇5個被測化合物（鞣花酸、異槲皮苷、山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷、椴樹苷和覆盆子苷-F5）的提取率最高，70%，100%甲醇提取時山柰酚的提取效率無差異，綜合考慮其他被測化合物的提取效率，故選擇70%甲醇為提取溶劑。對比提取時間（20，30，40，50，60 min）在70%甲醇為提取溶劑，料液比為1∶20，超聲重複提取，2次條件下，對6個被測化合物提取的影響，結果表明提取時間大於30 min時與30 min對6個化合物的提取沒有差異，故選擇30 min為提取時間。另外以70%甲醇為提取溶劑，料液比1∶20，超聲提取30 min的條件下，考察了重複提取次數（1，2，3次）對被測化合物提取的影響，結果表明第3次提取均檢測不出6個被測化合物峰，結果表明2次能夠高效、完全提取藥材中的6種化合物。由於ELSD檢測器的檢測限較高，為了獲得更好的檢測效果，在測定覆盆子藥材中覆盆子苷-F5時，將藥材的提取液體積濃縮至1/3。
3.2紫外吸收波長的選擇本研究對化合物分別進行190～600 nm波長掃描，鞣花酸，異槲皮苷，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷，椴樹苷和山柰酚的最大吸收波長分別為254，256，266，316，262 nm，且在265 nm各個化合物均有較好的紫外吸收，故選擇265 nm為吸收波長。覆盆子苷-F5無紫外吸收，選擇蒸發光散色檢測器對其進行檢測。
3.3分析條件的選擇本實驗考察了不同色譜柱包括Agilent Zorbax SB-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， Hypersil ODS （4.6 mm×250 mm， 5 μm）和 Diamonsal C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）對6種化合物分離的影響，結果表明Agilent Zorbax SB-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）能夠獲得較好的峰形和分離度。