HPLC測定覆盆子中鞣花酸、黃酮和覆盆子苷—F5的含量
化學
作者：何建明 孫楠 吳文丹 範莉姣 郭美麗
[摘要]該研究建立了HPLC-UV同時測定覆盆子藥材中鞣花酸、異槲皮苷、山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷、椴樹苷和山柰酚含量以及HPLC-ELSD測定覆盆子苷-F5含量的方法。實驗結果表明，各化合物的標準曲線線性關係良好（R2 >0.999 5），檢測限為0.297～90.144 ng，定量限為0.990～300.480 ng，加樣回收率為97.11%～101.7%（RSD≤2.1%）。不同產地覆盆子藥材中各化合物的含量差異較大，其中鞣花酸的產量與緯度呈正相關，總黃酮含量在東部產地藥材中較高，且覆盆子苷-F5含量在安徽亳州藥材中最高。該研究建立的方法簡便、準確、靈敏、重複性好，為覆盆子藥材的進一步研究開發，品質評價和質量控製提供了科學依據。
[關鍵字]覆盆子；含量測定；鞣花酸；黃酮；覆盆子苷-F5
[收稿日期]2013-06-06
[通信作者]* 郭美麗，Tel/Fax：（021）， E-mail：
[作者簡介]何建明，碩士研究生，E-mail：中藥覆盆子（Rubi Fructus）為薔薇科懸鉤子屬植物掌葉覆盆子Rubus chingii Hu的幹燥未成熟果實，具有益腎、固精、縮尿之功效，用於腎虛遺尿、小便頻數、陽痿早泄、遺精滑精等[1]。現代研究表明，覆盆子主要成分有鞣質、萜類、黃酮等，藥理作用主要有抗誘變作用，改善學習記憶能力，延緩衰老，增強免疫，對性腺軸有調控作用等[2]。鞣花酸為覆盆子中鞣質的主要成分，具有良好的抗炎、抗誘變和抗菌作用等[3-5]。異槲皮苷，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷，椴樹苷和山柰酚為覆盆子中黃酮類的主要成分，藥理學研究表明，其均具有抗氧化，抗炎等作用[6-9]。覆盆子的化學成分研究已經發現7個半日花烷型二萜苷，其主要成分為覆盆子苷-F5。目前《中國藥典》2010年版對覆盆子藥材的質量控製方法尚不完善，還沒有定量檢測的方法和指標。本文以鞣花酸、異槲皮苷，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷，椴樹苷，山柰酚和覆盆子苷-F5為指標，建立了HPLC同時測定其含量的方法，並對不同產地覆盆子樣品進行了含量測定，旨在為覆盆子的資源開發以及質量評價和控製提供科學依據。
1材料
安捷倫1100係列高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；SEDEX 85型蒸發光散色檢測器（法國SEDERE公司）；SB 25-12DTD超聲清洗器機（寧波新芝生物科技有限公司）；TL-5.0W台式離心機（上海離心機械研究所）；METTLER AE 240 1/10 萬電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）。乙腈為色譜純（傑帝貝柯化工產品貿易（上海）有限公司），水為重蒸水，其他試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司），鞣花酸（批號，純度為98.8%）購於上海同田生物技術有限公司，異槲皮苷（批號-，純度為99.5%）購於中國食品藥品檢定研究院，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷、椴樹苷、山柰酚和覆盆子苷-F5均由本實驗室分離純化得到，其結構經波譜鑒定，數據與文獻報道一致[10-12]，HPLC檢測純度均大於99.5%。
覆盆子未成熟果實分別采摘於浙江馨昌、貴州遵義、安徽亳州等16個產地，均為由綠變綠黃時采摘、60℃幹燥，經第二軍醫大學藥學院郭美麗教授鑒定為掌葉覆盆子R. chingi的幹燥未成熟果實。
2方法與結果
2.1對照品溶液的製備分別精密稱取真空幹燥至恒重的鞣花酸（20.56 mg），異槲皮苷（2.04 mg），山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷（5.23 mg），椴樹苷（3.96 mg），山柰酚（2.04 mg）置於50 mL量瓶中，稱取真空幹燥至恒重的覆盆子苷-F5（6.26 mg）於25 mL量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，經 0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得鞣花酸質量濃度為0.411 2 g·L-1，異槲皮苷0.040 8 g·L-1，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷0.1046 g·L-1，椴樹苷0.079 2 g·L-1，山柰酚0.040 8 g·L-1的混合對照品溶液和質量濃度為0.250 4 g·L-1的覆盆子苷-F5對照品溶液。
2.2供試品溶液的製備不同產地掌葉覆盆子的幹燥未成熟果實，置電熱恒溫鼓風幹燥箱中60 ℃幹燥至恒重，研細，過40目篩，精密稱取2.50 g置於具有塞錐形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，超聲30 min，3 000 r·min-1離心10 min，移除上清液，再重複上述操作1次，合並上清液，減壓濃縮，移至50 mL量瓶，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液為測定鞣花酸和黃酮含量的供試品溶液。精密量取上述供試品溶液30 mL，減壓濃縮，移至10 mL量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液為測定覆盆子苷-F5含量的供試品溶液。
2.3色譜條件Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃。HPLC-UV同時測定鞣花酸和黃酮時，流動相乙腈（A）-水（含0.1%乙酸，B），梯度洗脫，0～16 min，12%～20% A； 16～35 min，20%～44% A。流速為1 mL·min-1，進樣量為20 μL，測定波長為265 nm。在此條件下，5個化合物的保留時間在35 min以內，色譜峰分離度均大於1.5。HPLC-ELSD測定覆盆子苷-F5時，流動相乙腈（A） -水（B），梯度洗脫，流速為1 mL·min-1，0～5 min，75%～69% A； 5～12 min，69%～65%A。進樣量20 μL，ELSD 檢測器漂移管溫度40 ℃，以潔淨幹燥的壓縮空氣為霧化氣體，壓力0.35 MPa。
A. 混合對照品（鞣花酸和黃酮）；B. 對照品（覆盆子苷-F5）； C. 供試品（鞣花酸和黃酮含量測定）；D. 供試品（覆盆子苷-F5測定）；1. 鞣花酸；2. 異槲皮苷；3. 山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷；4. 椴樹苷；5. 山柰酚；6. 覆盆子苷-F5。