RP—HPLC同時測定山慈菇藥材中dactylorhin A和militarine的含量
化學
作者：崔保鬆 宋傑 李帥 馬林 石建功
[摘要]建立山慈菇藥材中dactylorhin A和militarine的RP-HPLC含量測定方法，為山慈菇藥材的質量標準研究提供依據。采用Alltech Prevail C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈（A）-水（B）為流動相進行梯度洗脫（0 min，20∶80；30 min，55∶45；35 min，55∶45）。流速為0.8 mL·min-1；檢測波長為224 nm；柱溫為30 ℃。dactylorhin A和militarine的線性範圍分別為0.257～9.95 μg（r=0.999 8），0.128～10.27 μg（r=0.999 9）；平均回收率（n=9）分別為94.70%，102.8%，RSD分別為4.2%，4.9%。采用RP-HPLC測定來源於獨蒜蘭和雲南獨蒜蘭的山慈菇藥材中dactylorhin A和militarine的含量，該方法準確、重複性好，適用於來源於獨蒜蘭和雲南獨蒜蘭的山慈菇藥材的質量控製。
[關鍵詞]山慈菇；RP-HPLC；dactylorhin A；militarine；含量測定
[收稿日期]2013-08-04
[基金項目]《中國藥典》2010年版一部標準研究項目（YZ-205，YZ-206）
[通信作者]李帥，研究員，Tel：（010）， E-mail：
[作者簡介]崔保鬆，研究實習員，主要研究方向為天然藥物化學，Tel：（010），E-mail山慈菇為蘭科植物杜鵑蘭Cremastra appendiculata（D. Don）Makino、獨蒜蘭Pleione bulbocodioides（Franchise.）Rolfe或雲南獨蒜蘭P.yunnanensis Rolfe的幹燥假鱗莖。前者習稱“毛慈菇”，後二者習稱“冰球子”[1]。主要分布於雲南、貴州、四川等長江以南各省區[2]。山慈菇具有清熱解毒，消腫散結的功效，主要用於治療瘰鬁結核、咽喉腫痛等，在臨床上通常作為抗癌中藥配伍使用[3]。根據本課題組前期研究和部分文獻調研的結果，從杜鵑蘭[4-6]中發現了菲類化合物，聯苄類化合物，萜類化合物等；獨蒜蘭[7]中發現了二氫菲及菲類化合物，聯苄類化合物等；雲南獨蒜蘭中發現了二氫菲類化合物[8]和二苯基衍生物（聯苄類化合物）[9]。因此，菲類化合物和聯苄類化合物是山慈菇藥材中的主要特征性成分，活性研究結果表明[10]該類化合物具有一定的抗腫瘤細胞毒活性，可能是其具有抗癌作用的主要活性成分。但由於該類化合物在山慈菇藥材中數量較多，含量較低，極性小，並且結構不穩定，在光照等條件下容易改變，不適合作為HPLC含量測定的指標成分。
根據前期對山慈菇不同來源品種的化學成分研究結果，發現雙[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-異丁基蘋果酸酯-2-葡萄糖苷（dactylorhin A）和雙[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-異丁基蘋果酸酯（militarine）為來源於獨蒜蘭和雲南獨蒜蘭的山慈菇藥材的主要成分，經研究發現此類化合物是山慈菇中另外一類主要成分，即丁二酸苄酯苷類成分，研究發現此類化合物具有延緩衰老，改善衰老小鼠的學習記憶能力的作用[11-15]。因此選定這2個化學成分為山慈菇藥材含量測定的指標成分，可以反映來源於獨蒜蘭和雲南獨蒜蘭的山慈菇藥材特征。
1材料
山慈菇藥材，包括杜鵑蘭、獨蒜蘭和雲南獨蒜蘭 3個品種。經中國醫學科學院藥物研究所馬林副研究員鑒定。
Agilent 1100高效液相色譜儀，包括DAD紫外檢測器，ChemStation色譜工作站（Agilent 公司）；AB135-S/FACT型分析天平，1/10萬（METTLER TOLEDO）；KQ-300DE型數控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；色譜乙腈（Burdick&Jackson ACS/HPLC Certified）；娃哈哈純淨水。對照品dactylorhin A，militarine，自製，純度達到98%以上。
2方法與結果
2.1溶液的製備
2.1.1對照品溶液的製備精密稱取dactylorhin
對照品dactylorhin A，militarine的結構式
Fig.1Structural formula of dactylorhin A， militarine
A， militarine對照品適量，用甲醇溶解，分別製成0.3，0.5 g ·L-1的溶液，即得對照品溶液。
2.1.2供試品溶液的製備取山慈菇藥材粉末（過4號篩）1 g，精密稱定，置於具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇100 mL，浸泡1 h，然後超聲（功率1 000 W，頻率40 Hz）處理1 h，用幹燥濾器過濾。殘渣用50%乙醇淋洗後合並，將過濾液濃縮，殘渣用甲醇溶解並轉移到10 mL量瓶中，定容，搖勻，即得供試品溶液。
2.2色譜條件與係統適用性試驗
Alltech Prevail C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-水（B）為流動相進行梯度洗脫（0 min，20∶80；30 min，55∶45；35 min，55∶45）。流速0.8 mL·min-1；檢測波長224 nm；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。