分別取對照品溶液及供試品溶液各5 μL ，在上述色譜條件下，注入液相色譜儀測定，記錄色譜圖。本實驗條件下，樣品色譜dactylorhin A，militarine的保留時間分別為10，15 min，與其他化學成分能達到基線分離，其色譜峰與相鄰色譜峰分離度良好（與相鄰峰的分離度均大於1.5），符合高效液相色譜定量分析的要求。理論塔板數以dactylorhin A計為5 000以上。
2.3方法學考察
2.3.1線性關係考察分別精密吸取dactylorhin A，militarine對照品溶液，用甲醇稀釋成含dactylorhin A質量濃度分別為0.051 4，0.102 8，0.257，0.514，1.06，1.99 g·L-1；militarine質量濃度分別為0.025 675，0.102 7，0.205 4，0.513 5，1.027，2.054 g·L-1的對照品溶液。吸取5 μL進樣，記錄色譜圖。以進樣量（μg）為橫坐標X，峰麵積為縱坐標Y，繪製標準曲線，得到dactylorhin A， militarine的回歸方程（n=6）分別為：Y=1 751.6X-63.199，
1.dactylorhin A；2. militarine。
對照品（A），杜鵑蘭（B），獨蒜蘭（C）和雲南獨蒜蘭樣品（D）的HPLC圖
Fig.2The chromatograms of reference substance（A）， Cremastra appendiculata（B）， Pleione bulbocodioides（C） and Pleione yunnanensis（D）
r=0.999 8；Y=1 893X-69.795，r=0.999 9；線性範圍分別為0.257～9.95，0.128～10.27 μg。
2.3.2精密度試驗精密稱取對照品分別製成0.257，0.513 g·L-1的樣品，各吸取5 μL，按2.2項色譜條件下，連續進樣6次，根據峰麵積的結果計算dactylorhin A，militarine 的RSD分別為1.3%，1.4%。結果表明儀器分析過程中精密度良好。
2.3.3穩定性試驗精密吸取供試品溶液5 μL，分別於0，1，2，4，8，16，24 h進樣，在2.2項色譜條件下測定，根據測定峰麵積的結果計算dactylorhin A，militarine的RSD分別為1.3%，1.4%。結果表明，供試品溶液在24 h內穩定。
2.3.4重複性試驗取同一批次的雲南獨蒜蘭藥材粉末（40目）約1 g，精密稱定，按2.1.2項下方法製備供試品溶液5份，在2.2項色譜條件下進行含量測定。5份樣品中dactylorhin A，militarine的平均含量為0.38%，0.81%，RSD分別為2.4%，1.8%，說明方法重複性良好。
2.3.5加樣回收率試驗取同一批已知含量的藥材粉末（過4號篩）9份（dactylorhin A含量0.15 %），每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入dactylorhin A對照品0.5，1，2倍量各3份。按2.1.2項下方法製備所需溶液，在2.2項色譜條件下測定，計算dactylorhin A回收率（n = 9）。
取同一批已知含量的藥材粉末（過4號篩）9份（militarine含量0.32 %），每份1 g，精密稱定，分別精密加入militarine對照品0.5，1，2倍量各3份。按2.1.2項下方法製備所需溶液，在2.2項色譜條件下測定，計算militarine回收率（n=9）。
2.4樣品測定
取不同來源山慈菇藥材和飲片的粉末，按2.1.2項下的方法製備供試品溶液，並按2.2項下色譜條件進行測定。山慈菇3種來源的藥材中dactylorhin A和militarine的含量。
3討論
3.1對照品純度檢查方法
采用HPLC等度洗脫，分別采用DAD檢測器和蒸發光散射檢測器進行檢測，樣品在210，224，254，280，300 nm以及蒸發光散射檢測器下，除樣品峰外都沒有檢測的其他峰，樣品峰峰麵積百分比達到100%；增加進樣量達到樣品出現平頭峰時，仍然未檢測出其他色譜峰。樣品峰的峰純度分析報告顯示峰純度達到98%。對照品核磁共振圖譜顯示沒有其他雜質信號。
3.2山慈菇藥材含量測定結果的比較
本文分別測定了藥典中3個品種的山慈菇藥材中主要成分dactylorhin A和militarine，根據含量測定的結果發現不同品種來源的山慈菇藥材中這2個主要成分的含量有較大差別：來源於雲南獨蒜蘭的山慈菇藥材中這2個化合物均有，且較高含量，因此可以用dactylorhin A和militarine來控製來源於雲南獨蒜蘭的山慈菇藥材質量標準；來源於獨蒜蘭的山慈菇藥材中隻含有militarine，而dactylorhin A幾乎沒有檢測到，因此用militarine這一個指標成分可以控製來源於獨蒜蘭的山慈菇藥材質量標準；來源於杜鵑蘭的山慈菇藥材中這2個化合物均未檢測到，此方法不適用來源於杜鵑蘭的山慈菇藥材質量標準，但可以用於區分3種植物來源的山慈菇藥材。