茯苓化學組分拆分及不交叉性研究
化學
作者：林喆 徐煜彬 冉小庫 竇德強
[摘要]通過水蒸氣蒸餾法、水提醇沉法、液液萃取法和大孔吸附樹脂柱色譜法的聯合應用，建立茯苓化學組分的拆分方法，利用主成分分析和聚類分析方法對茯苓化學拆分組分進行不交叉的定性分析；采用夾角餘弦、平方歐式距離和生藥峰麵積交叉分析法對茯苓化學拆分組分進行不交叉的半定量分析。結果表明，將茯苓化學成分拆分為多糖組分、石油醚萃取組分、乙酸乙酯萃取組分、樹脂醇洗組分和樹脂水洗組分，且各化學拆分組分差異度在80%以上，並對其主要成分進行標識。該實驗建立茯苓化學組分的拆分方法，工藝具有良好的穩定性和重複性，能夠對茯苓全部化學成分進行拆分，並且首次采用半定量分析方法對組分之間的不交叉性進行了分析。
[關鍵詞]茯苓；化學拆分組分；不交叉性分析
[收稿日期]2013-07-23
[基金項目]國家重點基礎研究發展計劃（973）項目（2013CB）；2013遼寧省高等學校創新團隊項目（LT）
[通信作者]竇德強，Tel：（0411），E-mail
[作者簡介]林喆，碩士研究生，E-mail中藥活性或有效部位的研究，一般需要對水煎液或醇提液進行拆分，以評價哪一部位的活性最強。但各拆分部位之間的成分交叉性鮮有評價，為進一步活性組分的最終確定增加了不確定因素。本實驗以茯苓為例，通過幾種方法嚐試，建立其拆分組分不交叉性評價的新方法，為後續的拆分組分性味評價奠定基礎。
茯苓為多孔菌科植物真菌茯苓Poria cocos （Schw.） Wolf 的幹燥菌核，性平，味甘、淡，主入脾經，具有利水滲濕、健脾寧心的作用，主要含有多糖、三萜酸類等有效化學成分[1-2]。根據文獻報道，茯苓中多糖具有免疫增強作用[3]，三萜類物質具有抗炎[4]和利尿作用[5]，本實驗對茯苓的全部化學成分進行組分拆分，通過多種方法對化學拆分組分進行定性和半定量的不交叉分析，並對拆分組分的化學成分進行表征，為拆分組分的不交叉分析提供一種新的標識方法。
1材料
FD-EA-50冷凍幹燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司），DZF-6050真空幹燥箱（上海一恒科技有限公司），YQ-A3-SS-048高速冷凍離心機（Eppendorf公司），RE-85Z旋轉蒸發器（鞏義市英峪予華儀器廠），HH-S型水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司），Agilent HPLC 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠），KQ-250 DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），PCJ-10係列超純水機（成都品成科技有限公司），CP225D電子天平（Sartorius公司）。
石油醚（沸點60～90 ℃）（天津市進豐化工有限公司）、乙酸乙酯（天津市進豐化工有限公司）和磷酸（天津市大茂化學試劑廠）均為分析純，甲醇（天津市大茂化學試劑廠）和乙腈（Oceanpak Alexative Chemical）均為色譜純，超純水，食用乙醇，D-101型大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）。
茯苓，2012年11月購自雲南省騰衝縣，經遼寧中醫藥大學藥用植物教研室王冰教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓P. cocos的幹燥菌核。
2方法與結果
2.1茯苓化學組分拆分方法的建立
稱取茯苓粉末100 g，加水至生藥材的10倍量，浸泡2 h，加熱回流2 h，趁熱用濾布過濾；殘渣再加水至生藥材的10倍量，加熱回流1 h。采用水蒸氣蒸餾法，即得揮發油。蒸餾後的水煎液減壓濃縮至生藥材的1倍量，加95%乙醇，使醇沉濃度為80%，0～5 ℃靜置過夜，離心（8 000 r·min-1，10 min），收集上清液和沉澱；沉澱加少量水溶解，水浴揮至無醇味，再加水至生藥材的1倍量，醇沉第2次，0～5 ℃靜置過夜，離心（8 000 r·min-1，10 min），收集沉澱，合並2次上清液[6]。沉澱依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，冷凍幹燥後，即得多糖組分。
將醇沉後的上清液減壓濃縮至無醇味，加水至生藥材的1倍量，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取8次，每次所加的有機溶劑量為生藥材的0.5倍量，分別得到石油醚萃取物Ⅰ和乙酸乙酯萃取物Ⅰ。剩下的水層水浴揮至無乙酸乙酯味，加水至生藥材的1倍量，通過D-101大孔吸附樹脂柱色譜（上樣量為1 g生藥材-3 mL濕樹脂），依次用10倍柱體積的水、4倍柱體積的95%乙醇洗脫，收集相應的洗脫液。水層洗脫液減壓濃縮，冷凍幹燥後，即得到樹脂水洗組分。95%乙醇洗脫液減壓濃縮至無醇味，加水至生藥材的0.25倍量，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取3次，每次所加的有機溶劑量為生藥材的0.125倍量，將得到的石油醚萃取物Ⅱ和乙酸乙酯萃取物Ⅱ分別與前麵石油醚萃取物Ⅰ和乙酸乙酯萃取物Ⅰ合並。剩下的水層減壓濃縮，冷凍幹燥，即得到樹脂醇洗組分。由於獲得的揮發油含量極少，並且DAD檢測器得到的圖譜中揮發油與石油醚萃取物有交叉的部分，因此，將揮發油與石油醚萃取物Ⅰ和Ⅱ合並為1個化學組分，即為石油醚萃取組分；乙酸乙酯萃取物Ⅰ和Ⅱ合並為乙酸乙酯萃取組分。
Fig.1Sequential extraction system of splitted fractions from Poria cocos
2.2茯苓化學拆分組分指紋圖譜的測定
為了確保茯苓化學組分拆分方法的合理性、可行性和穩定性，本實驗對石油醚萃取組分、乙酸乙酯萃取組分、樹脂醇洗組分和樹脂水洗組分製備10批，並進行HPLC指紋圖譜的比較。
2.2.1色譜條件Kromasil C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測器為二極管陣列檢測器（DAD）；以乙腈（A）-磷酸水（B）為流動相梯度洗脫，0～10 min（5% A），10～55 min（5%～60% A），55～65 min（60% A），65～85 min（60%～75% A），85～90 min（75%～95% A），90～110 min（95% A）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長242，210 nm[9]。
2.2.2指紋圖譜分析所建立的指紋圖譜在242，210 nm處檢測的色譜峰相似度均在0.90以上，相互吻合程度較高，說明工藝的穩定性較好。
2.3茯苓化學拆分組分的表征
為闡明各化學拆分組分中化學成分的種類和結構，本實驗通過反複色譜柱對茯苓化學拆分組分的化學成分進行分離純化，利用核磁共振技術定性鑒定，在2.1.2項下建立的公共指紋圖譜，上對茯苓化學拆分組分中的化學成分進行化學表征。將建立的茯苓化學拆分組分的公共指紋圖譜與從相應化學拆分組分中分離得到的單體化合物的HPLC圖進行色譜峰的對比，並進行譜峰的標記，共標記了7個色譜峰，其中1號峰為鄰苯二甲酸二辛酯，2號峰為鄰苯二甲酸二丁酯，屬於石油醚萃取組分；3號峰為茯苓酸，4號峰為去氫茯苓酸，5號峰為豬苓酸C，屬於乙酸乙酯萃取組分；6號峰為3-吲哚乙醇，7號峰為苯丙氨酸，屬於樹脂醇洗組分。