長期服用人參皂苷大鼠尿液代謝組學研究
藥代動力學
作者：謝燮 陳少秋 呂穎芳 王曉豔 賈偉
[摘要] 人參因對機體的整體調節和促進作用，其長期服用具有一定滋補功效。然而其滋補作用的靶點以及長期服用對於機體可能帶來的毒副作用並不是很明確，尿液代謝組學的方法因其非侵入、同時監測機體整體代謝狀態的特點，適用於中藥的長期藥效及藥理毒理研究。該研究以實驗大鼠為對象，利用代謝組學技術分析其尿液代謝物組成的動態變化，分析長期服用人參主要有效成分——人參總皂苷對大鼠機體尿液代謝譜的影響。結果顯示短期和長期服用人參皂苷均不會對正常大鼠尿液的代謝組造成非常顯著的影響（主成分分析分組不能成功建模），相比之下，服用人參皂苷在短期內（1～3周）對機體尿液的代謝譜影響最大，包括能量代謝、兒茶酚胺類物質以及氨基酸類神經遞質代謝，中期（6～10周）作用的逐漸減小，長期（27周）幾乎無作用，同時證明短期和長期服用人參皂苷對機體無明顯的毒副作用。
[關鍵詞] 人參皂苷；尿液；代謝組學
[收稿日期] 2014-04-18
[基金項目] 國家自然科學基金項目（30901997）；上海交通大學SMC-晨星學者計劃項目（B類）；國家重點基礎研究發展計劃項目（2012CB910102）
[通信作者] *王曉豔，副研究員，主要從事中藥藥理與代謝組學研究，Tel/Fax：（021）34207343，E-mail
人參學名Panax ginseng，又被稱為亞洲參，因其珍貴的藥用價值被稱為“百草之王”，多年來一直是中外學者的研究熱點[1]。《本草綱目》中提到人參能治一切機體虛症，《神農本草經》中也認為，人參有“補五髒、定魂魄、安精神、除邪氣、止驚悸、明目益智”的功效，“久服輕身延年”，對於體弱多病的人尤其療效顯著，對於正常人群也適宜用作冬季進補和春季養陽。人參發揮滋補作用的關鍵在於每次少量，連續服用一段時間為宜[2]。人參的主要藥效成分包括皂苷類、有機酸及其酯化產物、揮發油、甾醇、氨基酸、多肽、糖類、維生素類、黃酮類、微量元素、木質素等，而其中皂苷類物質含量最高，側根部分總皂苷含量可達60%，被認為是人參藥材的主要功效成分[3]。
人參皂苷（ginsenoside）是一種固醇類的三萜皂苷，對機體生理調節功能非常廣泛，包括物質代謝、免疫激素和內分泌係統、腦和神經係統、生殖係統和胃腸道係統等[3]。因此用一種方法能夠動態監測其對機體多個係統長期作用的影響，將有助於闡明人參皂苷滋補功效的作用靶點，並能發現其長期服用可能帶來的毒副作用。
代謝組學作為係統生物學一個重要的分支，考察不同時刻受過不同外界環境刺激或擾動的生物體係的代謝組進而研究生物體係代謝通路變化的一門組學學科[4-5]。因其易標準化的特性現已廣泛應用於疾病診斷、毒性研究、營養學研究、環境研究等許多領域。前期的代謝組學研究表明人參皂苷類物質能夠調節機體內神經遞質相關代謝物的表達水平，從而達到抵禦應激、疲勞、衰老和癌症的功效[6-7]。本研究通過對大鼠進行為期27周的人參皂苷喂養，分析尿液中代謝物組成隨時間的變化，研究短期和長期服用人參皂苷對機體整體代謝的影響。
1 材料
1.1 實驗動物 潔淨級Wistar雄性大鼠23隻，300 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，大鼠於室內保持12 h/12 h晝夜並給予標準飼養，控製室內相對濕度在40%左右。
1.2 試劑及藥品 人參總皂苷（純度大於85%）購自湖南諾澤生物科技有限公司。尿素酶，分析純十七酸，分析純氯苯丙胺酸，分析純甲氧胺，分析純吡啶購自Sigma-Aldrich公司，色譜純甲醇購自Merck公司，矽烷化試劑BSFTA購自安普生物科技有限公司。
1.3 儀器 氣相色譜-質譜聯用儀（氣相色譜儀為Agilent 6890N型號，飛行時間質譜儀為Leco Pegsus HT型號）；大鼠新型代謝籠（蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司）；5415R冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Milli.Q Adventage超純水係統；Forma-80 ℃超低溫冰箱（美國Thermo公司）；XS105精密稱量天平（美國Mettler toledo公司）。
2 方法
2.1 實驗動物和給藥 將23隻雄性Wistar（34周）大鼠，適應培養1周後隨機分成空白對照組（12隻，C組）和人參皂苷組（11隻，CT組）從實驗第1天開始，C組服用蒸餾水，CT組服用人參總皂苷100 mg·kg-1。
2.2 尿液樣本收集 分別在服藥前24 h（0周）服藥後1，3，6，10，27周，將大鼠置於代謝籠中收集尿液樣本。將原始尿液樣本在3 000 r·min-1下離心10 min，之後取尿液上清分裝，置於-80 ℃冰箱保存。
2.3 尿液的GC/TOF分析 本次實驗采用三甲基矽烷化（TMS）衍生化GC-MS方法測定大鼠尿樣中小分子內源性代謝物質[8]。尿液樣本解凍後，渦旋混勻離心12 000 r·min-1 10 min。取上清50 μL，加入10 μL尿素酶，37 ℃反應15 min。加入1 g·L-1的十七酸（內標）10 μL，0.3 g·L-1氯苯丙氨酸（內標）10 μL，振蕩離心5 min，取上清於室溫下真空幹燥，加甲氧胺和BSFTA 80 μL， 70 ℃反應60 min。室溫下放置1 h後進樣分析。
2.4 圖譜數據處理和建模 以相似度≥700為標準，利用自建的標品庫和商業譜庫鑒定GC-MS總離子圖譜中每個代謝物峰歸屬。將得到的樣品的GC-MS總離子圖譜文件通過數據轉換、峰辨識、對齊和歸一化等計算過程，最終得到一個由指定的峰序列號、觀測點以及歸一化後的峰強度組成的三維矩陣，將其導入SIMCA-P 13.0軟件中進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）鑒別造成聚集和離散的主要差異變量（VIP>；1）同時輔以CT組與C組同一代謝物峰麵積相比差異倍數（Fold Change）和單維T-test檢驗來觀察各個差異在各個時間點的變化[8]。
3 結果
3.1 代謝組隨時間變化的動態分析 在本批實驗樣本中共檢測並鑒定到125個代謝物，主成分分析結果表明長期服用人參皂苷並不會對大鼠尿液的代謝組造成極顯著影響。0周時，C組與CT組無分離趨勢，服用人參皂苷1周後，C組與CT組的PCA得分圖似乎呈現出一定分離趨勢，但之後的分離趨勢逐漸消失，27周後幾乎無分離趨勢，所有時間點兩組數據PCA分組均不能成功建模。隨著時間變化的PCA得分軌跡圖服用人參皂苷對機體代謝組的影響在1周左右達到最大，之後的差異會逐漸減小。
3.2 差異代謝物的變化趨勢 從代謝物的差異倍數熱圖分布來看，與正常組大鼠數據相比，服用人參皂苷1周後大鼠體內的差異代謝物多數下調，僅有對甲苯酚（p-cresol）保持較強的上調狀態。而從第3周開始，L-乳酸（L-lactic acid）、異檸檬酸（isocitric acid）、高香草酸（homovanillic acid）等代謝物開始呈現上調趨勢，甘氨酸（glycine）、胸腺嘧啶（thymine）和反式阿魏酸（trans-ferulic acid）保持下調狀態，其它代謝物在2組間均無顯著性差異。服用人參皂苷半年之後，大部分代謝物無變化，僅有抗壞血酸（ascorbic acid）呈上調狀態。