2.6 MeCP2 siRNA幹擾RA模型大鼠FLS MeCP2表達 采用LipofectamineTM2000 （Invitrogen）轉染試劑向模型組大鼠FLS轉染MeCP2 siRNA和陰性對照scrambled片段，轉染後Real time qPCR檢測MeCP2，SFRP2表達。
2.7 統計學分析 數據分析采用SPSS 17.0軟件，所有數據結果均以±s表示，組間比較采用One-way ANOVA檢驗，P<；0.05表示差異有統計學意義。
3 結果與分析
3.1 MeCP2在RA模型大鼠FLS中表達 為研究甲基化結合蛋白MeCP2在對照大鼠和RA模型大鼠滑膜中的表達差異，采用Real time qPCR和Western blotting檢測MeCP2在對照大鼠和RA模型大鼠FLS中表達。與對照組相比，MeCP2 mRNA在RA模型大鼠FLS中表達顯著升高，MeCP2蛋白在RA模型大鼠FLS中表達顯著升高，提示MeCP2可能對RA大鼠病理機製有重要作用。
3.2 PULC灌胃治療抑製 RA模型大鼠FLS中MeCP2表達 PULC 100 mg·kg-1灌胃治療後，采用real time qPCR和Western blotting檢測MeCP2在模型組和治療組大鼠FLS中的表達差異。與模型相比，MeCP2 mRNA在治療組大鼠FLS中表達顯著降低，MeCP2蛋白在治療組大鼠FLS中表達顯著降低。結合本課題組前期研究發現，在RA模型大鼠中SFRP2表達顯著降低，PULC能夠上調SFRP2表達、抑製Wnt信號，提示PULC可能通過下調MeCP2表達上調SFRP2表達，PULC對RA大鼠有治療作用。
3.3 PULC灌胃治療對RA模型大鼠FLS增殖的影響 采用MTT檢測PULC灌胃治療對FLS異常增殖的影響。結果PULC灌胃治療後，RA大鼠FLS增殖活力顯著降低。
3.4 MeCP2 siRNA轉染對SFRP2，β-catenin表達的影響 分離培養RA模型大鼠FLS，約1×104個FLS種植於6孔板中，待細胞長滿70%～90%後，采用LipofectamineTM 2000轉染試劑轉染MeCP2 siRNA至培養的RA大鼠FLS中，采用Real time qPCR檢測MeCP2表達抑製對SFRP2，β-catenin mRNA表達的影響。發現MeCP2表達抑製後，SFRP2 mRNA表達顯著升高，β-catenin mRNA表達顯著降低。提示在RA大鼠病理變化中MeCP2對SFRP2有直接的抑製作用；上調表達的MeCP2可能抑製SFRP2的表達，抑製Wnt信號，SFRP2的低表達可能與DNA甲基化有關。
4 討論
MeCP2是DNA甲基化結合蛋白，是突觸和神經細胞保持自身穩定的關鍵基因。MeCP2的正常表達是維持中樞神經係統正常功能的關鍵因素[8]。本課題組前期研究發現，SFRP2基因在RA模型大鼠滑膜中表達顯著降低，可能引發Wnt信號的激活，促進FLS的增殖。低表達的SFRP2基因是否可能與SFRP2基因甲基化修飾相關，本研究發現
MeCP2在RA模型大鼠FLS中表達顯著升高，幹擾MeCP2表達後，SFRP2表達顯著升高。提示在RA模型大鼠病理中，異常上調表達的MeCP2可能抑製SFRP2表達，並以此影響Wnt信號活性，影響RA病理機製。
激活的FLS調控滑膜慢性炎症和骨的侵蝕，在RA發病機製中起關鍵作用[9]。FLS在關節軟骨降解生成抗原引發的免疫應答中發揮重要的作用，促進了炎症的發生。FLS促進SDF-1和其他內皮細胞生長因子，包括成纖維細胞生長因子VEGF，FGF介導的血管再生[10-11]。由於FLS是大鼠滑膜組織的原代細胞，與關節滑膜中的FLS具有相同的生物學特性，因此，FLS是RA研究和RA治療藥物研究常用的樣本材料。鑒於FLS在RA病理中的關鍵作用，本實驗采用RA模型大鼠FLS作為對象，研究MeCP2在對照和RA模型大鼠滑膜中的表達差異和MeCP2表達抑製對SFRP2表達的影響。
《神農本草經》、《唐本草》等記載白頭翁有清熱解毒、明目、涼血、消贅等功效，是重要的中藥材。白頭翁根含豐富的皂苷類成分，主要是白頭翁皂苷A，B，C，D等。本課題組前期研究發現，在RA模型大鼠中SFRP2表達顯著降低，經PULC灌胃治療後，RA模型大鼠FLS中SFRP2表達上調，Wnt信號通路關鍵基因β-catenin和C-myc表達明顯下調，提示PULC對SFRP2有上調作用，可能通過SFRP2的上調抑製Wnt信號，抑製RA病理變化。鑒於前期研究發現50，100，150 mg·kg-13個劑量PULC灌胃治療對Wnt信號都有影響，因此本實驗選擇中間劑量100 mg·kg-1作為大鼠灌胃給藥的劑量。為深入探討SFRP2在RA模型大鼠中低表達原因，本文研究甲基化結合蛋白MeCP2在RA模型大鼠中的表達，探討MeCP2表達抑製對SFRP2表達的上調作用，為RA疾病的防治提供新的思路。
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