白頭翁皂苷影響RA模型大鼠FLS MeCP2表達
藥理
作者：繆成貴 周國梁 秦梅頌 陳建中 李成鳳 何華奇
[摘要] 研究中藥白頭翁主要活性成分白頭翁皂苷（PULC）對類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis， RA）模型大鼠MeCP2表達的調控作用。采用佐劑性關節炎大鼠為RA模型，原代培養RA模型大鼠滑膜成纖維細胞樣滑膜細胞（FLS），Real time qPCR， Western blotting檢測100 mg·kg-1PULC灌胃治療對RA模型大鼠FLS MeCP2表達的調控作用，MTT檢測PULC治療對FLS增殖的影響，MeCP2 siRNA幹擾RA模型大鼠FLS MeCP2表達後SFRP2，β-catenin表達的變化。檢測發現經100 mg·kg-1PULC灌胃治療後，RA模型大鼠FLS中MeCP2表達明顯降低，SFRP2表達升高，RA模型大鼠FLS增殖活力降低，MeCP2 siRNA抑製RA模型大鼠FLS MeCP2表達後，SFRP2表達明顯上調，β-catenin表達明顯降低。PULC可能通過抑製MeCP2表達上調SFRP2表達，抑製RA模型大鼠滑膜Wnt通路活性，抑製RA模型大鼠滑膜異常增殖。
[關鍵詞] 白頭翁皂苷； 類風濕性關節炎； MeCP2； SFRP2； Wnt
[收稿日期] 2014-04-12
[基金項目] 國家自然科學基金項目（81302783）；安徽省高校振興計劃人才項目（098）；安徽省質量工程項目（2013zy057）；滁州市科技局科研項目（201306）；安徽省教育廳科研項目（KJ2012Z069）；安徽科技學院第十一批校大學生創新課題（14XSF162，14XSZ164）
[通信作者] *繆成貴，博士，研究方向為抗炎免疫藥理學，E-mail
類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種多關節性、係統性免疫疾病，世界範圍發病率0.5%～1.0%，我國發病率約為0.5%[1-2]。發病機製目前仍不清楚，成纖維細胞樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）在RA病理變化中發揮重要作用[3-4]。Wnt通路的激活促進RA的發生發展，在RA病理中Wnt信號通路關鍵基因β-catenin和C-myc基因表達明顯升高[5-6]。本課題組前期研究發現RA模型大鼠FLS中SFRP2基因表達明顯下調，經100 mg·kg-1白頭翁皂苷（pulchinenoside，PULC）灌胃治療後，RA模型大鼠FLS中Wnt信號通路上遊負調控因子SFRP2表達上調，Wnt信號通路關鍵基因β-catenin和C-myc基因表達明顯下調，PULC通過對Wnt通路的調控抑製RA模型大鼠滑膜異常增殖[7]。DNA甲基化結合蛋白MeCP2能夠甲基化修飾靶基因，導致靶基因表達下調，為進一步探討RA模型大鼠中SFRP2基因表達降低的原因及MeCP2的作用，本文采用Real time qPCR， Western blotting等方法研究MeCP2在RA大鼠和對照大鼠中的表達差異，采用MeCP2 siRNA轉染等方法研究MeCP2表達抑製對SFRP2表達的影響，研究100 mg·kg-1PULC灌胃治療對RA模型大鼠FLS中MeCP2表達的影響，對RA模型大鼠FLS增殖的影響，探討MeCP2在RA病理中的重要作用，為RA疾病防治提供新的思路。
1 材料
Applied Biosystems Gene Amp StepOneTM Real-Time qPCR System（美國ABI公司）；電泳儀（Bio-rad）；半幹轉膜儀（Bio-rad）；倒置顯微鏡（奧林巴斯）；ChemiScope3400 Mini化學發光成像（上海勤翔科學儀器有限公司）；倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯）；101AS-3型數顯恒溫幹燥箱（上海浦東躍欣科學儀器廠）；CO2培養箱（Thermo）；超淨工作台（江蘇淨化儀器設備有限公司）。
白頭翁皂苷（上海一林生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒（Fermentas）；QuantiFast SYBR Green PCR試劑盒（Qiagen公司）；MeCP2抗體（Santa）；SFRP2抗體（Anbo）；Western裂解液（上海碧雲天生物技術有限公司）；MeCP2，SFRP2定量PCR引物（上海生工）。
2 方法
2.1 RA模型大鼠 SD雄性大鼠，體重180～200 g，安徽醫科大學實驗動物中心提供（合格證號皖醫動準01號），隨機分為3組：正常組、模型組、白頭翁皂苷100 mg·kg-1，每組10隻。模型組以福氏完全佐劑於每隻大鼠右後足趾皮內注射0.1 mL致炎，正常對照組注射0.1 mL PBS。
2.2 大鼠滑膜FLS原代培養 致炎後第28天股動脈放血處死大鼠，分離大鼠雙側膝關節滑膜組織，用無Ca2+，Mg2+的D-Hanks液反複漂洗3次後剪成約1～2 mm3小塊。用彎頭吸管吸取數小塊均勻排列在培養瓶中的底壁上，瓶底朝上置37 ℃，5%CO2培養箱內培養7 h後翻正培養。待滑膜FLS長出組織塊成團塊狀後棄除組織塊，繼續培養至細胞覆蓋瓶底90%，胰蛋白酶消化細胞傳代培養。實驗用細胞為傳代3～5次FLS。
2.3 MTT檢測FLS增殖活性 用含15%小牛血清 的DMEM培養液製備FLS懸液（4×108個/L），96孔培養板中每孔加100 μL， 37 ℃，5%CO2培養24 h。貼壁後更換培養液100 μL，繼續培養72 h後，每孔加5 g·L-1MTT 10 μL。繼續培養4 h，吸棄上清液，加入二甲基亞碸100 μL，振蕩30 s，酶標儀檢測，結果以3個複孔的均值表示。
2.4 Real time qPCR檢測MeCP2，SFRP2基因表達 Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄酶逆轉錄得到cDNA。定量PCR引物由上海生工合成。定量PCR擴增反應條件為：94 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s。共40個循環。定量PCR引物序列。
2.5 Western blotting檢測MeCP2，SFRP2蛋白表達
Western blotting裂解液充分裂解滑膜組織，每孔上樣20 μL總蛋白。SDS-PAGE電泳後半幹轉蛋白至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉3 h，加一抗，一抗MeCP2均是1∶500稀釋。4 ℃過夜後加二抗，室溫孵育2 h，ECL發光試劑盒顯影，以β-actin為內參，分析條帶吸光度。