張居正上任首輔後，首先就是給隆慶皇帝的兩位遺孀上尊號。因為新皇上登基，老皇上的後妃要升格為“太”字輩，如太後、太妃等。明朝進封製度規定：“新天子登基，尊老皇後為皇太後，若有生母，亦封為太後，但加徽號以示分別。”這意思是，陳皇後是當然的皇太後，李貴妃作為皇上的生母，也可以進封皇太後。但是，為了顯示兩個皇太後的差別，則應在陳皇太後前邊加兩個字的尊號。馮保與張居正商量：鑒於李貴妃擔負著小皇上的監護作用，兩宮太後不應該有差別，都應加兩個字尊號。雖然，這件事在禮部實施過程中遭到一些官員的反對，但因張居正的強力支持，最終獲得通過。陳皇後的尊號是仁聖皇太後，李貴妃是慈聖皇太後。從此，兩宮太後遂無差別。
陳太後與李太後兩人，打從認識一直到死，始終感情和睦、親如姐妹。李太後地位比陳太後低下時，她對陳太後奉事唯謹。後來母以子貴，她與陳太後身份齊平但實際占優時，她對陳太後依然奉事唯謹。每天清晨，她都會帶著兒子到陳太後處請安。一年三百六十五日天天如此，風雨無阻。這一點令陳太後非常感動，她多次要李太後取消這個禮節。李太後的回答是：“老輩子傳下的規矩，在我手上不能改。”兩人始終以姐妹相稱。在明代，後妃之間這樣的親密無間，是難得的佳話。
李太後對陳太後的尊敬，為她贏得了廣泛的讚譽。但是，對待自己的兒子萬曆皇帝，她卻管教極嚴。兒子登基的頭幾年，她將國事托付給張居正，而讓兒子以讀書為主。
皇帝讀書，叫出經筵。張居正親自給萬曆皇帝挑選了六位講臣。每逢在文華殿聽講歸來，李太後便邀來陳太後，讓兒子將聽講的內容複述一遍。小皇上講完了，李太後就問陪皇上聽講的馮保，皇上講的是否有錯漏。如果全部都講對，就給予褒獎；如果有錯漏，就給予懲處。有好幾次，小皇上因為逃學而被罰長跪。
由於管教極嚴，萬曆皇帝對李太後充滿敬畏。萬曆六年（1578年），母子間曾發生過一次極為嚴重的衝突。其時，萬曆皇帝新婚不久，李太後便離開乾清宮，搬回慈寧宮居住。離開了母親的監護，萬曆皇帝有一種如釋重負的感覺，便在太監的唆使下，做一些往常不敢做的事情。一次夜遊西城，貼身侍應太監孫海為其找來兩位年輕貌美的宮女陪酒。喝得半醉時，萬曆皇帝要這兩位宮女唱時令新曲。所謂時令新曲，類似於今天的流行歌曲，但明代坊間的曲子，語頗輕佻，與時下東北民間的二人轉，庶幾近之。兩位宮女說不會唱，孫海在一旁慫恿，宮女仍堅持不唱，萬曆皇帝因此大怒，喝令推出斬首。經孫海提醒，萬曆皇帝這才醒悟殺人不是好玩的事情，於是改為削發代替斬首。
第二天，李太後知道了這件事情，找來那兩位驚魂未定花容失色的宮女，問明事情原委，頓時大怒。她跑到奉先殿祭告亡夫，竟然作出撤銷萬曆皇帝的九五至尊地位的決定，改讓潞王繼承皇位。