發酵完成後，取2ml發酵液以體積比1：1加入乙酸乙酯萃取，取上清液稀釋100倍，進高效液相色譜儀。色譜條件：柱，流動相甲醇：水=65：35，流速1.0ml/min，柱溫30℃，檢測波長240nm，進樣量20μL。
二、結果與分析
2.1不同比例的大豆油對甾醇轉化率的影響
大豆油對甾醇及AD均有較好的溶解性，在增加底物濃度的同時對細胞的毒性又較小，而單純的提高大豆油比例也會破壞油/水雙相平衡，影響細胞的生長代謝，同時也會造成生產上的浪費生產成本的增加。根據文獻及相關試驗摸索，大豆油含量20%左右，甾醇轉化率較高。
2.2不同投料量對甾醇轉化率的影響
甾醇是一種疏水性化合物，難溶於水，過量底物難以被大豆油溶解分散，且會對細胞產生毒性，不利於轉化率的提高，從而對原料造成浪費。在大豆油/水雙相發酵係統中，隨著甾醇投料量的增加，轉化率上升到一定水平後呈下降趨勢。當投料濃度達到1.5%時轉化率可達到85%左右，繼續提高甾醇投量至2%轉化率下降至80%以下。
2.3不同比例吐溫-80對甾醇轉化率的影響
表麵活性劑的分子結構與細胞膜相似，在微生物轉化過程中，它可以增加底物的溶解度，同時改變細胞膜的通透性。吐溫80是一種常見的水包油型表麵活性劑，試驗證明在大豆油/水雙相發酵培養基中添加吐溫80可有效提高甾醇轉化率，投量為0.2%時，轉化率可達到85%左右。低於該濃度，其對甾醇的溶解能力及對細胞膜通透性影響較小，而高於該濃度，則破壞細胞膜通透性，轉化率均不能達到理想水平。
2.4正交試驗
根據單因素試驗結果，選擇大豆油投料濃度，底物甾醇投料濃度和吐溫80投料濃度3因素，以AD轉化率為考察指標，設計L9（3）4正交試驗，正交試驗設計及極差分析。
正交試驗分析表明，各因素影響從主到次分別為A（大豆油濃度）、B（甾醇濃度）、C（吐溫80濃度）。最優方案為A2B2C3，即大豆油20%，甾醇投量1.5%，吐溫80濃度0.2%，此方案最高轉化率87.27%。
方差分析結果可以看出，三因素對轉化率均有影響，都不顯著。但是與其他發酵係統相比，甾醇的轉化率有較大提高，優化試驗對大規模化生產具有一定指導意義。
三、結論
（1）構建大豆油/水雙液相發酵係統，可以有效解決甾醇難以溶解乳化的問題，與傳統單水相發酵相比，不僅產率有大幅提高，且更安全、環保。
（2）在大豆油/水雙液相發酵係統中，研究了大豆油在發酵液中所占比例、甾醇投料濃度以及添加表麵活性劑如吐溫80等因素對產物轉化率的影響，對AD的工業化生產具有一定的指導意義。
（3）通過正交試驗，確定了甾醇生物降解的最佳工藝條件。最佳工藝條件：大豆油20%，投料量1.5%，添加0.2%吐溫-80，轉化96h，植物甾醇轉化率達到87.3%。
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