雙液相係統中分枝杆菌降解植物甾醇為雄烯二酮的工藝優化
科技專論
作者：柏挺
【摘要】雄烯二酮（AD）是製備甾體激素類藥物不可替代的中間體。本文在基於15L小試發酵規模上，優化大豆油/水雙液相係統中分枝杆菌降解植物甾醇為雄烯二酮（AD）的工藝。研究了大豆油在發酵液中的最佳比例，植物甾醇的投料量以及添加表麵活性劑對提高植物甾醇轉化率的影響，得到最佳轉化工藝條件：大豆油20%，投料量1.5%，添加0.2%吐溫-80，轉化96h，植物甾醇最終轉化率為87.3%。
【關鍵詞】雙相係統；分枝杆菌；雄烯二酮；植物甾醇；表麵活性劑
雄甾-4-烯-3，17-二酮（androst-4-ene-3，17-dione，簡稱AD），是製造甾體激素類藥物合成的關鍵中間物質之一，幾乎所有的甾體激素藥物都是以AD作為起始原料進行生產的[1]。目前國內主要從野生中藥材“穿地龍”等植物中提取薯蕷皂苷元後經化學合成而成，工藝十分複雜，成本很高，而且汙染環境[2]。
微生物降解甾醇的工作開始於20世紀60年代，已發現多種微生物可將植物甾醇側鏈選擇性的切除得到AD[3]。微生物法生產AD主要受甾醇在水中溶解度低的限製，甾醇在水中的溶解度低於2mg/L，產物AD在水中的溶解度也不高於50mg/L[4]，甾體化合物的難溶性是限製微生物轉化工業化最主要的障礙之一。傳統的單水相發酵多采用添加少量有機溶劑、表麵活性劑的方法來提高甾醇在發酵液中的溶解度，效果並不理想，而且有機溶劑等對細胞產生毒性以及對安全、環保等因素影響，從而製約了其在工業化上的應用。采用大豆油/水雙液相發酵係統，可以有效增加甾醇的溶解度，提高底物投料量，而且減少了對細胞的毒性。本文主要研究了大豆油在發酵液中所占比例，植物甾醇的投料量以及添加表麵活性劑對植物甾醇轉化率的影響。
一、材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌種
分枝杆菌Mycobacterium sp-XHL-501（上海新華聯製藥有限公司菌種室保藏）。
1.1.2 試劑
甾醇為進口甾醇，大豆油購於上海良友海獅油脂實業有限公司，吐溫80購於上海申宇醫藥化工有限公司，其他試劑均為國產分析純。
1.1.3 培養基
斜麵培養基（g/L）：牛肉膏5；胰蛋白腖10；葡萄糖25；瓊脂20，滅菌後pH6.8-7.2。
種子培養基（g/L）：葡萄糖 8；玉米漿 65；酵母膏 4；NaNO3 5；（NH4）2HPO4 0.5，滅菌後pH6.8-7.2。
轉化培養基（g/L）：大豆油200；甾醇15；玉米漿65；酵母膏 4；NaNO3 5；（NH4）2HPO4 0.5，吐溫80 1.5，滅菌後pH6.8-7.2。
1.2 儀器設備
美國安捷倫1260高效液相色譜儀；上海國強生物工程有限公司3L玻璃發酵罐、15L不鏽鋼立式發酵罐。
1.3 方法
1.3.1 斜麵培養
將菌種接種到斜麵培養基，30℃培養箱內培養3天。
1.3.2 種子培養
將3L發酵罐內裝入2L培養液，121℃滅菌30min，滅菌後pH6.8-7.2。30℃接入斜麵種子，攪拌速度200r/min，培養48h左右移種。
1.3.3 發酵轉化培養
將15L發酵罐內裝入10L培養液，121℃滅菌30min，滅菌後pH6.8-7.2。30℃時以10%接種量接入種子液，初始攪拌速度200r/min，24h後逐漸提高轉速至500r/min，用65%磷酸維持pH8.0，發酵轉化96h。
1.3.4 轉化率計算方法