2.3 紅花化學組分的製備 稱取紅花藥材200 g，用50%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，合並提取液，過濾，濃縮幹燥後得A01組分。A01組分通過大孔樹脂進行分離，依次用水、20%，40%，95%乙醇洗脫，收集各洗脫液後分別濃縮，得B01，B02，B03及B04組分。用製備液相色譜進一步分離B02，B03和B04組分，從第5 min開始接樣，在5～65 min每3 min接1個組分，流速10 mL·min-1；流動相水（A）-乙腈（B）；B02洗脫梯度0～50 min（3%～20% B），50～64 min（20%～50% B），64～67 min（50%～100% B），67～70 min（100% B），B03洗脫梯度0～40 min（15%～30% B），40～55 min（30%～45% B），55～60 min（45%～80% B），60～64 min（80%～100% B），64～70 min（100%～100% B），B04洗脫梯度0～20 min（20%～30% B），20～40 min（30%～45% B），40～55 min（45%～90% B），55～60 min（90%～100% B），60～70 min（100% B），B02，B03，B04分別製備得到C01～C20，D01～D20及E01～E20組分。
2.4 紅花活性組分篩選 實驗中實際篩選了53個組分（D15，D17，D19，D20，E05，E07，E11，E13，E16，E17，E19，E20組分製備量過少，不能滿足篩選需要）。稱取適量的組分，用DMSO溶解獲得質量濃度為50 g·L-1的儲備液。細胞毒實驗表明，0.05 g·L-1的E15，E18有細胞毒作用，實驗質量濃度降為0.01 g·L-1，其他組分實驗質量濃度為0.05 g·L-1。HK-2細胞以5 000個/孔接種於96孔細胞板，置於細胞培養箱中孵育24 h使細胞貼壁。吸去舊培養液，加入80 μL培養液和10 μL含0.5 g·L-1（E15，E18組分質量濃度為0.1 g·L-1）待篩選組分的培養液，預保護15 min後加入10 μL含50 μmol·L-1鹽酸阿黴素的培養液，實驗另設溶劑對照組（含0.1% DMSO），模型組（含5 μmol·L-1鹽酸阿黴素），陽性對照組（含5 μmol·L-1鹽酸阿黴素和500 μmol·L-1的鹽酸川芎嗪），每組3複孔，孵育24 h。吸去舊培養液，每孔加入100 μL含1.5 mg·L-1 FDA，1 mg·L-1 MTR及5 mg·L-1 Hoechst 33342的高糖DMEM基礎培養基，37 ℃避光孵育15 min，按2.1操作獲取每孔的熒光信息，以相對熒光強度反映細胞活力狀態。實驗數據用±s表示，采用SPSS統計軟件進行統計學處理，結果發現，C17，C18，C19組分與細胞作用後，3種探針的相對熒光強度值與模型組相比均升高，具有顯著或極顯著差異。按下式計算C17，C18及C19對HK-2細胞的保護率：保護率=（樣品組熒光強度值-模型組熒光強度值）/（溶劑對照組熒光強度值-模型組熒光強度值）×100%。
2.5 活性組分的鑒定 采用LC-MS技術對C17，C18，C19組分進行鑒定。色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；流動相0.05%甲酸-水（A）-乙腈（B）；流速0.6 mL·min-1；洗脫梯度0～30 min（10%～20% B），30～50 min（20%～50% B），50～65 min（50%～95% B），65～70 min（95% B）。C17，C18，C19組分及對照品的HPLC-PDA色譜。
通過與對照品的保留時間、紫外吸收和質荷比（m/z）比對，鑒定峰1，6，7，8分別為羥基紅花黃色素A、蘆丁、異槲皮素和山柰酚-3-O-芸香糖苷。峰2～5由於缺乏對照品，通過多級質譜數據進行初步
1.羥基紅花黃色素A；6.蘆丁；7.異槲皮素；8.山柰酚-3-O-芸香糖苷。
鑒定，峰2在負離子模式下的準分子離子峰為m/z 771，根據二級質譜信息，其側鏈含有1分子葡萄糖和1分子芸香糖，參照文獻信息[4]推測峰2為6-羥基山柰酚-3-O-芸香糖-6-O-葡萄糖苷。同理，通過質譜信息和文獻報道，推測峰3為6-羥基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷[4]或6-羥基山柰酚-6，7-二-O-葡萄糖苷[5]，峰4為6-羥基山柰酚-3-O-芸香糖苷[6]，峰5為6-羥基山柰酚-3-O-葡萄糖苷[4]或6-羥基山柰酚-7-O-葡萄糖苷[7]。
2.6 4個化合物對HK-2細胞保護作用的考察 將異槲皮素、蘆丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷及羥基紅花黃色素A分別稀釋成5個濃度（100，50，25，12.5，6.25 μmol·L-1），評價其對鹽酸阿黴素損傷的HK-2細胞的保護作用，步驟同2.4。結果表明，4個化合物對鹽酸阿黴素損傷的HK-2細胞均具有一定程度的保護作用。其中羥基紅花黃色素A保護作用最弱，山柰酚-3-O-芸香糖苷及蘆丁保護作用較強，異槲皮素保護作用最強，且在6.25～100 μmol·L-1對HK-2細胞保護作用具有良好的量效關係，在FDA，MTR，Hoechst 33342 3種熒光探針標記下，100 μmol·L-1時對HK-2保護率分別為（66.22±5.75）%，（77.31±5.15）%，（63.55±5.78）%。
3 討論
HK-2細胞源於正常成年人腎近端小管上皮細胞，保留了腎小管上皮細胞大部分的生物學特性[8]，可用於腎保護和腎毒性的研究[9-10]。阿黴素是常用的腎損傷造模藥物，其腎毒性的主要機製為阿黴素進入腎髒後通過氧化還原反應生成半醌自由基中間體，從而對細胞的膜結構和功能產生氧化損傷[11]；另外，阿黴素作為DNA損傷劑類化療藥物，可以直接作用於細胞DNA，對細胞核產生損傷。因此本研究選用與鹽酸阿黴素損傷機製相關的熒光探針標記HK-2細胞用於腎保護活性物質的篩選。
熒光標記技術具有簡便、靈敏的特點，已經成為體外藥物篩選的重要技術之一。但單色熒光標記用於藥物篩選研究時，獲得的信息單一，不利於全麵評價化合物對細胞的作用。本研究采用3種熒光探針FDA，MTR及Hoechst 33342標記HK-2細胞用於腎細胞保護活性物質的篩選。FDA標記細胞可以反映細胞膜的完整性[12]； MTR是一種線粒體選擇性熒光探針，在線粒體內的積累與線粒體膜電位相關[13]，線粒體受損後，其膜電位降低，熒光強度也隨之降低；Hoechst 33342能與DNA雙鏈上堿基特異性結合，DNA損傷加重時，結合在DNA上的熒光探針減少，熒光強度相應減弱，因此采用這3種熒光探針對細胞進行標記，能獲得組分或化合物對細胞膜、線粒體及細胞核三方麵作用的信息，可以較為全麵的評價對腎細胞的保護作用，從而提高腎保護活性物質發現的效率。
采用建立的HK-2細胞損傷模型對紅花53個化學組分進行篩選，運用LC-MS技術對活性組分進行定性分析，共推測出8個化合物，與對照品比對後確認其中4個化合物分別為異槲皮素、蘆丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷和羥基紅花黃色素A，並對其活性進行驗證，發現它們均具有一定的腎細胞保護作用。本研究中羥基紅花黃色素A的腎細胞保護作用最弱，可能是羥基紅花黃色素A的油水分配係數最小，極性最大，不易通過細胞膜進入細胞發揮作用。異槲皮素、蘆丁及山柰酚-3-O-芸香糖苷3個化合物中異槲皮素腎細胞保護活性最強，山柰酚-3-O-芸香糖苷最弱，結構分析發現這3個化合物均擁有相同的母核，但在酚羥基數目和3位取代基上存在不同，蘆丁和異槲皮素具有4個酚羥基，而山柰酚-3-O-芸香糖苷具有3個酚羥基，異槲皮素在3位上的取代基是葡萄糖，但蘆丁和山柰酚-3-O-芸香糖苷在3位上的取代基是芸香糖，提示本研究中異槲皮素、蘆丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷腎細胞保護作用的強弱可能與其結構中酚羥基數目和糖取代基類型有關。