基於三色熒光探針的紅花腎保護活性物質篩選研究
藥理
作者：蘭小紅 肖舜 龔婉 王毅 趙筱萍
[收稿日期] 2014-02-10
[基金項目] 國家“重大新藥創新”科技重大專項（2012ZX0930400）
[通信作者] *趙筱萍，教授，博士生導師，Tel：（0571）86633138， E-mail
[作者簡介] 蘭小紅，碩士研究生，E-mail
[摘要] 該研究采用3種熒光探針FDA，MTR，Hoechst 33342對鹽酸阿黴素損傷的HK-2細胞進行標記，通過細胞熒光顯微成像平台進行熒光圖像采集及分析，建立了一種潛在的腎保護活性物質篩選方法。應用該方法對紅花的53個化學組分進行篩選，發現C17，C18，C19 3個組分對鹽酸阿黴素損傷的HK-2細胞具有較好的保護作用，運用液相色譜質譜聯用（LC-MS）技術對其進行定性分析，初步推測出8個化合物，羥基紅花黃色素A，6-羥基山柰酚-3-O-芸香糖-6-O-葡萄糖苷，6-羥基山柰酚-3，6-二-O-葡萄糖苷或6-羥基山柰酚-6，7-二-O-葡萄糖苷，6-羥基山柰酚-3-O-芸香糖苷，6-羥基山柰酚-3-O-葡萄糖苷或6-羥基山柰酚-7-O-葡萄糖苷，蘆丁，異槲皮素和山柰酚-3-O-芸香糖苷。與對照品比對後確認其中4個化合物為異槲皮素、蘆丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷及羥基紅花黃色素A，並對這4個化合物的腎細胞保護作用進行了驗證，發現均具有一定的腎細胞保護作用，其中異槲皮素的保護作用最強，且具有良好的量效關係。實驗結果提示，異槲皮素、蘆丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷及羥基紅花黃色素A可能是紅花發揮腎保護作用的活性成分。
[關鍵詞] 熒光探針；腎保護；活性物質篩選；紅花
慢性腎病是一種常見的複雜性疾病，在我國成人中的發病率為10.8%，已成為影響我國公眾健康的主要疾病之一[1]。腎小管上皮細胞損傷是慢性腎病持續進展的重要因素[2]，因此，篩選對腎小管上皮細胞具有保護作用的物質對慢性腎病治療藥物的發現具有重要意義。基於細胞熒光顯微圖像的多色熒光標記技術可以在一次篩選中獲得待篩樣品對細胞多方麵的作用信息，是一種高效的藥物發現方法[3]。本研究采用3種不同顏色的熒光探針FDA、MTR及Hoechst 33342同時標記鹽酸阿黴素損傷的HK-2細胞，構建了一種基於三色熒光探針標記的腎細胞損傷模型，並與LC-MS技術相結合，用於中藥紅花腎細胞保護活性物質的篩選研究，旨在為腎保護活性物質的快速發現提供一種新方法。
1 材料
1.1 儀器 細胞熒光顯微成像平台（浙江大學藥學院藥物信息學研究所自主研發）；Bio-Tek ELX 800酶標儀（Bio-Tek公司，美國）；CO2細胞培養箱（Thermo公司，美國）；1300係列Ⅱ級A2型生物安全櫃（Thermo公司，美國）；Anke LXJ-ⅡB低速大容量多管離心機（上海安亭科學儀器廠）；Agilent 1100型高效液相色譜儀，配二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、PDA檢測器及LCQ Deca XPplus 離子阱質譜檢測器（Finnigan質譜公司，美國）。
1.2 藥物和試劑 乙腈（色譜純，Merck公司）；二甲基亞碸（dimethylsulfoxide， DMSO，百靈威科技有限公司）；甲酸（色譜純，Tedia公司）；二乙酸熒光素（fluorescein diacetate， FDA），Hoechst 33342（Sigma公司）；MitoTracker Red CMXRos（MTR， Invitrogen公司）；Pen Strep（Gibco公司）；高糖DMEM基礎培養基，Fetal Bovine Serum，Trypsin EDTA（Corning公司）；鹽酸阿黴素（批號130509-200301）、蘆丁（批號100080-200707）、羥基紅花黃色素A（批號111637-200905）購於中國食品藥品檢定研究院；鹽酸川芎嗪（批號42763）購於阿拉丁試劑有限公司；山柰酚-3-O-芸香糖苷（批號121109）、異槲皮素（批號130920）購於上海融禾醫藥科技有限公司；紅花（產地新疆，批號120801）購於浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司，經浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司鄭建寶主管中藥師鑒定為菊科植物紅花的幹燥花。
1.3 細胞係 人腎近端小管上皮細胞係（human kidney proximal tubular epithelial cell line， HK-2，上海複祥生物科技有限公司）。
2 方法與結果
2.1 熒光探針標記HK-2細胞的濃度選擇 取對數生長期的HK-2細胞，以5 000個/孔接種於96孔板，置於細胞培養箱中孵育24 h，使細胞貼壁。吸去舊培養液，每孔加入100 μL含不同質量濃度梯度FDA（8，6，3，1.5，0.75，0.375 mg·L-1），MTR（8，6，4，2，1，0.5 mg·L-1）及Hoechst 33342（40，20，10，5，2.5，1.25 mg·L-1）的高糖DMEM基礎培養基，37 ℃避光孵育15 min，棄上清，PBS漂洗1次，吸幹，在熒光倒置顯微鏡下采集每孔細胞的熒光圖像，並統計各孔熒光強度。
FDA質量濃度在0～3 mg·L-1時，熒光強度隨FDA濃度的增加而增強，熒光強度值與FDA濃度之間具有良好的線性關係（R2 =0.968 7），當FDA質量濃度為1.5 mg·L-1時，鏡下觀察到細胞染色均勻、圖像清晰，且采集得到熒光圖片背景幹擾小，因此本實驗選擇1.5 mg·L-1 FDA對HK-2細胞進行標記。同理，本實驗中MTR和Hoechst 33342的質量濃度分別定為1，5 mg·L-1。
2.2 鹽酸阿黴素損傷HK-2細胞濃度的選擇 用3種熒光探針FDA，MTR，Hoechst 33342對HK-2細胞進行標記，通過熒光強度的變化反映鹽酸阿黴素對HK-2細胞的損傷程度。HK-2細胞以5 000個/孔接種於96孔板，置於細胞培養箱中孵育24 h使細胞貼壁。吸去舊培養液，每孔加入90 μL培養液，再依次加入10 μL含7.812 5，15.625，31.25，62.5，125，250，500，1 000 μmol·L-1鹽酸阿黴素的培養液，實驗另設溶劑對照組（含0.1% DMSO），每組3複孔，孵育24 h。吸去舊培養液，每孔加入100 μL含1.5 mg·L-1 FDA，1 mg·L-1 MTR及5 mg·L-1 Hoechst 33342的高糖DMEM基礎培養基，37 ℃避光孵育15 min，按2.1操作獲取每孔的熒光信息，以相對熒光強度反映細胞活力狀態。按下式計算相對熒光強度：相對熒光強度=（損傷組熒光強度值/溶劑對照組熒光強度值）×100%。
隨著鹽酸阿黴素濃度的升高，FDA，MTR和Hoechst 33342熒光強度逐漸下降，表明HK-2細胞損傷程度隨著鹽酸阿黴素損傷劑量的加大而增強，3.125～6.25 μmol·L-1的鹽酸阿黴素對HK-2細胞的損傷程度相對比較適中，因此本實驗采用5 μmol·L-1的鹽酸阿黴素對HK-2細胞進行損傷。