2.3 分組與處理 裸鼠適應性喂養1周後,按隨機數字表法分為6組:空白對照組、荷瘤對照組、順鉑組、補中益氣湯高、中、低劑量組,每組10隻。除空白對照組外裸鼠給予腹股溝皮下接種A549/DDP細胞懸液0.2 mL/隻,觀察各組成瘤情況,待肉眼觀察到移植瘤出現時,空白對照組、荷瘤對照組給予生理鹽水0.5 mL灌胃;順鉑組給予等量生理鹽水灌胃的同時,腹腔注射順鉑2 mg·kg-1;補中益氣湯高、中、低劑量組分別給予高、中、低濃度的補中益氣湯(98.5,49.3,24.6 g·kg-1)灌胃,同時腹腔注射順鉑2 mg·kg-1,每日1次,共14 d。測皮下移植瘤的最大長徑(a)和橫徑(b),計算腫瘤體積(腫瘤體積=a×b2/2)。末次給藥24 h後處死裸鼠,無菌剝離瘤體,計算體積抑瘤率及藥物對抑瘤作用的提高率[抑瘤率=(對照組瘤體積-藥物組瘤體積)/對照組瘤體積×100%;抑瘤作用提高率=(藥物組抑瘤率-對照組抑瘤率)/對照組抑瘤率×100%],取各組裸鼠的脾、胃、肺器官,一部分用4%甲醛固定後,4 ℃冰箱保存。另一部分置於-80 ℃冰箱保存。
2.4 裸鼠脾、胃、肺中PI3K,AKT蛋白表達的檢測 將固定後的樣本取出,經常規脫水,透明、浸蠟,包埋後,將每個樣本蠟塊連續切片3張,每張厚約4~5 μm。切片常規脫蠟至水,PBS清洗5 min×3次,高壓熱修複,內源性過氧化物酶阻斷,PBS清洗5 min×3次,加一抗37 ℃孵育1 h,PBS清洗5 min×3次,加二抗37 ℃孵育45 min,PBS清洗5 min×3次,DAB顯色,透明後封片。以PBS代替一抗作為陰性對照組。免疫組化結果采用Image Pro Plus醫學圖像分析係統進行圖像分析,在400倍高倍鏡下,隨機取5個視野,每個視野為2 592×1 944像素點,分別測出陽性反應細胞的總麵積(Area) 和積分吸光度(IA),求出平均吸光度。
2.5 實時定量PCR方法(Real-time PCR)檢測裸鼠脾、胃、肺中PI3K,AKT mRNA的表達 在PCR反應體係中加入熒光染料,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,最後對未知模板進行相對定量分析。利用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物,PCR。取各組樣品,分別進行脾、胃、肺總RNA的提取,待樣本純度檢測計算合格後,按逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄合成cDNA。各基因完成PCR擴增循環後,進行產品熔解曲線分析,以確定產品純度。根據PCR產物熔解曲線的平均熔解溫度確定產物的純度。如果產物特異, 熔解曲線無雜峰, 平均熔解溫度一致。
2.6 統計學處理 利用SPSS 16.0軟件對數據進行統計學分析。計量資料采用±s表示,多組間比較如符合正態分布、方差齊時,采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK法。不符合參數檢驗時,采用多組計量資料秩和檢驗,P[3]應用補中益氣湯對晚期肺癌患者化療毒副反應的觀察中發現惡心、嘔吐以及白細胞及尿素氮、肌酐的異常率明顯下降,體力狀況Karnafsky評分改善率優於對照組。從中醫角度分析應用補中益氣湯是補虛扶正、培本固元、益氣補血、健脾補腎,整體上達到扶正驅邪的效果。