2.1.4.3 穩定性試驗 取梔子金花丸（北京同仁堂製藥有限公司，批號2083009）粉末約0.2 g，精密稱定，按2.1.2項下方法製備供試品溶液，分別於供試品溶液製備後0，2，4，6，8，10，12，24 h進樣，測定供試品溶液中小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰麵積，計算RSD。結果上述各待測成分峰麵積的RSD分別為1.7%，0.11%，0.10%，0.058%，0.53%，0.13%，0.34%，0.19%，0.17%，2.7%，結果表明24 h 內供試品溶液的穩定性良好。
2.1.4.4 重複性試驗 取同一批號的梔子金花丸（北京同仁堂製藥有限公司，批號2083009）粉末（過40目篩） 約0.2 g，精密稱定，進樣，按2.1.2 項下方法平行製備6 份供試品溶液，分別測定小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰麵積，計算含量及RSD。結果測得上述各待測成分的質量分數分別為3.72，6.17，2.40，17.0，0.300，4.88，0.712，0.616，1.27，0.365 mg·g-1，RSD分別為0.79%，1.1%，1.0%，0.61%，0.78%，0.59%，0.86%，0.61%，0.42%，1.4%，結果表明該方法的重複性良好。
2.1.4.5 加樣回收試驗 取已知含量的梔子金花丸（北京同仁堂製藥有限公司，批號2083009）粉末約0.1 g（黃芩素的加樣回收試驗取梔子金花丸粉末約0.01 g），精密稱定，分別按樣品含量-對照品大約1∶1加入一定量的對照品溶液，按2.1.2 項下方法製備供試品溶液，測定並計算小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的的加樣回收率以及RSD。結果上述各待測成分的平均加樣回收率分別為100.7%，103.3%，99.89%，103.1%，103.4%，103.4%，102.1%，99.15%，97.66%，100.2%，RSD分別為1.3%，1.0%，1.3%，1.4%，0.69%，0.81%，1.5%，0.50%，0.69%，1.5%，結果表明該方法的準確度良好。
2.2 相對校正因子的確定
2.2.1 相對校正因子的計算
按2.1.4.1項下試驗方法和所得各成分回歸方程，以大黃素為內參物，根據相對校正因子計算公式f k/s=ak / as（a為各成分回歸方程的斜率，s為內參物，k為其他待測組分），分別計算小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內參物大黃素的相對校正因子。
2.2.2 相對校正因子的重複性試驗
按2.1.3 項下方法，平行製備5份混合對照品溶液，分別進樣不同體積，以被測物的峰麵積和進樣質量用最小二乘法進行線性回歸，得到各待測成分的回歸方程，根據2.2.1項下的公式計算相對校正因子。5次平行試驗所得小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與大黃素間相對校正因的平均值分別為1.01，0.427，0.541，0.887，1.39，0.793，1.22，1.48，1.01；RSD分別為1.7%，2.5%，2.9%，4.3%，4.1%，2.8%，3.8%，3.1%，3.1%，表明相對校正因子的重複性良好。
2.2.3 相對校正因子的耐用性考察
2.2.3.1 不同儀器對相對校正因子的影響 采用Syncronis C18色譜柱分別測定了2台Shimadzu LC20A高效液相色譜儀和1台Waters Alliance高效液相色譜儀下各待測成分間的相對校正因子。結果表明，小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內參物大黃素間相對校正因子的重現性良好，RSD在0.83%～4.8%。
2.2.3.2 不同色譜柱對相對校正因子的影響 采用Shimadzu LC20A高效液相色譜係統，分別測定了Syncronis C18，Welchrom C18，Spursil TM C18，Accurasil C18 4種不同填料色譜柱下各待測成分間的相對校正因子。結果表明，小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內參物大黃素間相對校正因子的重現性良好，RSD在0.47%～3.1%。
2.2.3.3 不同流速對相對校正因子的影響 采用Shimadzu LC20A高效液相色譜係統和SpursilTM C18色譜柱，分別測定了不同流速（0.95，1.0，1.05 mL·min-1）下各待測成分間的相對校正因子。結果表明，小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、大黃 酸、大黃酚和大黃素甲醚與內參物大黃素間相對校正因子的重現性良好，RSD在0.069%～1.6%。
2.2.3.4 不同柱溫對相對校正因子的影響 采用Shimadzu LC20A 高效液相色譜係統和SpursilTM C18色譜柱，分別測定了不同柱溫（29，30，31 ℃） 下各待測成分間的相對校正因子。結果表明，小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內參物大黃素間相對校正因子的重現性良好，RSD在0.53%～1.2%。
2.3 待測組分色譜峰的定位
2.3.1 保留時間差和相對保留值定位法
取2.1.3項下的混合對照品溶液，在Shimadzu LC20A高效液相色譜係統上，分別采用Syncronis C18，Welchrom C18，SpursilTM C18，Accurasil C18 4種不同填料色譜柱，測定並計算了待測成分小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與內參物大黃素間的相對保留值和保留時間差。結果顯示不同色譜柱下各待測成分間的保留時間差的波動較小，RSD[22]。實驗中，在Shimadzu LC20A高效液相色譜儀，SpursilTM，Welchrom，Syncronis 3個C18填料色譜柱；Waters Alliance 高效液相色譜儀，SpursilTM，Welchrom，Accurasil 3個C18填料色譜柱上，分別取2.1.3項下的混合對照品溶液及2.1.2項下的供試品溶液進樣，測定10個待測成分色譜峰的保留時間，並考察線性回歸法的定位效果。定位方法：以含n（n ≥ 2）個待測成分的混合對照品溶液分別在2根色譜柱上實測得到的保留時間為橫坐標和縱坐標進行線性回歸，得到待測成分保留時間的回歸方程。將所有待測成分對照品在1根C18色譜柱（參照色譜柱）上的實測保留時間代入回歸方程，計算得到各待測成分在另一色譜柱上的理論保留時間，即計算值。將計算值與實測值進行比較，並以相對誤差評價定位效果。